向日葵ACC氧化酶基因(HaACO1)的克隆及表达分析

目的:克隆向日葵中的ACC氧化酶基因(HaACO1),并对其进行生物信息学分析及盐胁迫表达分析,为理解向日葵ACC氧化酶生理功能并加强对ACO基因的利用奠定基础。方法:以前期从盐胁迫的内葵杂4号根中获得的ACC氧化酶基因片段4-4-7TDF(KM823963)为基础,通过RT-PCR和5'/3'RACE技术克隆ACO基因的全长cDNA序列,利用生物信息学软件对获得的cDNA序列及编码的蛋白质序列进行分析。同时采用PCR方法克隆基因组DNA(genemic DNA,gDNA)序列,并对其进行结构分析。利用实时荧光定量PCR分析Na Cl胁迫下向日葵根、下胚轴、叶中HaACO1的表达量和不同NaCl浓度及不同胁迫时间下根中Ha ACO1的表达量。结果:Ha ACO1的cDNA序列全长为1 135bp,其开放阅读框为942bp,编码313个氨基酸。预测其分子质量和等电点分别为35.84k Da和5.13,基因登录号为KP966508。HaACO1与已报道的多种植物的ACO基因核苷酸序列及其推导的氨基酸序列有较高的相似性,分别为76%~83%和77%~88%。gDNA起始密码子至终止密码子序列长1 018bp,包含2个外显子和1个内含子,基因登录号为KP988289。实时荧光定量PCR分析表明向日葵HaACO1在不同器官及不同NaCl浓度、不同时间诱导下存在特异性表达差异。结论:获得的向日葵HaACO1是植物ACO家族成员之一,该基因应答盐胁迫具有独特的表达模式。     

向日葵V-ATPasea3亚基基因的克隆及表达分析

采用RACE技术,从向日葵P50中克隆V-ATPase a3亚基基因c DNA全长,并进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR分析不同浓度、不同时间的Na Cl、ABA和PEG模拟干旱胁迫条件下V-ATPase a3亚基基因的表达特征,以及相同胁迫条件下该基因在向日葵不同器官的表达特征。序列分析表明,该基因c DNA全长2 873bp,含5'-UTR 109bp、3'-UTR 295bp及编码区2 469bp,编码822个氨基酸,其编码蛋白质的理论分子质量为204.55k Da,等电点为6.29,Gen Bank登录号为KU315054。该基因编码的蛋白质为疏水性的跨膜蛋白,亚细胞定位预测其在质膜上。向日葵V-ATPase a3亚基与已报道的10种植物的V-ATPase a3亚基的同源蛋白有高度相似的保守区域,在进化上与朝鲜蓟的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明,向日葵受到Na Cl、ABA和PEG模拟干旱三种非生物胁迫后,V-ATPase a3亚基基因均上调表达,但表达模式不同,不同器官存在特异性表达差异。研究认为,V-ATPase a3亚基基因响应了向日葵非生物胁迫的应答,为加强对V-ATPase基因的利用奠定基础。     

向日葵盐胁迫相关基因的cDNA-AFLP差异表达

目的:研究向日葵盐胁迫前后基因表达的变化,分离并鉴定耐盐相关基因。方法:采用c DNA-AFLP技术分析盐胁迫产生的差异表达基因片段。结果:从256对引物组合中筛选到232对有差异表达的引物组合。用其进行选择性扩增,获得差异表达的上调TDFs 845条。经二次PCR扩增及反向Northern blot验证,获得42个阳性TDFs。对其中12个TDFs进行克隆及序列测定,得到10条TDFs核苷酸序列。经Blastx比对及功能分析,10个TDFs均与应答盐胁迫相关,涉及信号转导相关蛋白、胁迫相关功能蛋白、衰老相关蛋白以及与蛋白相互作用有关的蛋白。结论:利用c DNA-AFLP技术鉴定出一批盐胁迫应答基因,为揭示向日葵耐盐分子机制及指导向日葵耐盐分子育种实践奠定基础。     

不同生态区域向日葵油酸含量对气候因子的响应规律

该研究以内蒙古自治区农牧业科学院选育的3个向日葵品种‘NKZ4’、‘NK244’和‘NK175’为试验材料,于2014和2015年在陕西武功、山西介休、内蒙古呼和浩特、辽宁沈阳、吉林长春、新疆乌鲁木齐和黑龙江齐齐哈尔7个不同生态条件的向日葵主产省区种植,测定各种植区主要环境气候因子以及各品种籽粒中油酸等脂肪酸组分含量,分析向日葵籽实油酸含量对气候因子的响应规律,并确定关键影响因子,探究气候因子对向日葵油酸形成的影响机理。结果表明：(1)不同生态区间向日葵品种籽实的脂肪酸含量差异较大,其油酸含量总体变化趋势为随纬度的增加而降低。(2)气候因子中日照时数、日均最高气温、日均最低气温、日均气温4个因子与向日葵油酸含量密切相关。(3)在向日葵各生育阶段和全生育期,籽实油酸含量与日照时数均呈显著负相关关系,与日均最高气温、日均气温呈显著正相关关系;在现蕾 开花阶段,油酸含量与平均风速呈显著负相关关系;在开花 成熟阶段和全生育期,油酸含量与日均最低气温呈显著正相关关系。研究发现,向日葵籽实油酸含量受种植区日均最高气温和日均气温影响最大,日均最高气温、日均气温升高5 ℃,籽实油酸含量由20%可上升至40%。     

向日葵转录因子HB-12的定位分析及过表达验证

向日葵转录因子HB-12属于HD-Zip I类转录因子家族,在植物逆境胁迫应答中发挥着极其重要的作用。该研究构建HB-12基因瞬时表达载体并进行亚细胞定位分析,表明HB-12基因定位于细胞核。构建HB-12基因植物超表达载体转化野生型烟草获得了转基因植株。进行了Na Cl胁迫对转基因烟草耐盐性检测、生理生化指标测定和胁迫相关基因的表达分析。结果表明,Na Cl胁迫条件下,转基因烟草叶色失绿程度较野生型的轻,分化情况较野生型的好,生长速度和生根率均较野生型的高;转基因烟草叶绿素和脯氨酸含量及POD和SOD活性均高于野生型烟草;与野生型烟草相比,转基因烟草P5CS、POD、Mn SOD和Gu Zn SOD相对表达水平显著提高。这说明,向日葵HB-12在转基因烟草中的过量表达可抑制叶绿素降解酶的活性,降低叶绿素的分解,还可诱导脯氨酸合成酶基因P5CS及抗氧化相关基因POD、Mn SOD和Gu Zn SOD的上调表达,促进脯氨酸的生物合成,增强POD和SOD的活性,提高烟草抵抗盐害的能力。该研究结果将为进一步探讨植物的耐盐机理及改良作物的耐盐性状奠定基础。     

向日葵E3泛素连接酶基因克隆及表达分析

该研究从向日葵中克隆了E3泛素连接酶基因HERC2,并进行了生物信息学分析和不同胁迫条件的表达分析。序列分析表明,HERC2(登录号为KT832066)序列的CDS为1 608bp,编码535个氨基酸,预测其分子量131kD,等电点为5.03。HERC2编码的蛋白质为疏水性蛋白质,且为细胞质蛋白;亚细胞定位预测分析表明,向日葵HERC2可能定位在高尔基体中;该蛋白质有5个RCC1保守结构域。向日葵HERC2与已报道的其他植物同源蛋白有相似的保守区域,与醉蝶花亲缘关系最近,而与大豆和野生大豆的亲缘关系最远。与HERC2cDNA对应的gDNA(登录号为KT832067)的ORF长度为3 409bp,与cDNA编码序列比对结果表明,该gDNA由5个外显子和4个内含子组成。实时荧光定量PCR分析表明,向日葵HERC2基因表达受非生物胁迫调节,在不同器官及不同非生物胁迫下存在特异性表达差异。研究认为,HERC2基因应答逆境胁迫具有其特定的表达模式,研究结果为加强对HERC2的利用奠定了基础。     

向日葵E3泛素连接酶基因的分析定位和表达鉴定

该研究利用前期获得的向日葵耐盐相关基因E3泛素连接酶基因序列(HERC2),构建瞬时表达载体Cam-35S-HERC2-GFP,采用基因枪法转化洋葱表皮细胞进行亚细胞定位;采用RT-PCR技术,分析盐胁迫下HERC2在耐盐品种P50和盐敏感品种P29根、下胚轴和叶中的表达差异;构建HERC2植物表达载体pPZP221-HERC2,采用农杆菌介导法将HERC2导入烟草,进行耐盐功能验证。结果表明:(1)HERC2蛋白定位在细胞膜、细胞质和细胞核中。(2)受到NaCl胁迫后,HERC2基因在耐盐品种P50和盐敏感品种P29中均上调表达,但耐盐品种中的表达量较高。(3)HERC2基因的表达,能够提高转基因烟草的耐盐性。该研究结果为进一步解析向日葵对盐胁迫的响应机制,以及耐盐新品种的选育奠定了基础。     

基于RNA-Seq的向日葵脂肪酸合成基因筛选与分析

向日葵(Helianthus annuus L.)是世界四大油料作物之一。为解析向日葵主要脂肪酸组分的生物合成分子机制,选用高油酸自交系J9、低油酸自交系P50为研究材料;采用错期播种同期采样试验,以液相色谱测定授粉后不同样品籽粒的脂肪酸组分与含量;利用RNA-Seq技术,对不同样品测序,获得各样品与脂肪酸合成相关的基因表达数据,以气象学数据、液相色谱数据、向日葵基因组数据和转录组数据为基础,采用生物信息学方法分析相关数据。结果表明：(1)高油酸向日葵材料脂肪酸组分和含量受温度影响小,而低油酸材料易受温度影响;(2)J9和P50的12个样本的高表达基因数在7500个左右,而中、低表达基因数相当,是高表达基因的两倍,约15000个;(3)品种特异性表达基因和品种间特异表达基因去除重复后,在J9和P50在-CK和S数据集得到15885个,GO功能富集获得的与脂质代谢直接相关的403个DEGs 映射到与的脂质代谢相关的KEGG代谢通路,累计29个DEGs直接参与了19条相关KEGG通路。本研究将为深入解析向日葵脂肪酸代谢分子机制提供新信息。