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目的:构建一个利用小鼠乳清酸蛋白(mWAP)基因座完整的上下游调控序列指导人溶菌酶(hLYZ)基因组序列在乳腺内特异性高效表达的mWAP-hLYZ杂合基因座,实现人溶菌酶的高效表达。方法:采用连续3步缺口修复的方法。首先,以pBR322载体作为骨架,插入预先合成的6个同源臂序列,构成能够连续进行3次缺口修复的基因抓捕载体。然后在大肠杆菌内利用λ噬菌体Red同源重组系统介导的同源重组方法:第一步,从含mWAP基因座的细菌人工染色体(BAC)上亚克隆8 kb的mWAP基因3’端完整侧翼序列到抓捕载体上;第二步,从含hLYZ基因的BAC上亚克隆5 kb的从起始密码子(ATG)到终止密码子(TAA)的hLYZ基因组序列;第三步,从mWAP BAC上亚克隆9kb的mWAP基因5’端完整侧翼序列,并使上述3个片段在抓捕载体上自动无痕地连接在一起。结果:构建了全长约22 kb的mWAP-hLYZ杂合基因座,经PCR扩增、限制性内切酶酶切和序列测定验证,构建的杂合基因座达到原mWAP基因座中mWAP基因组编码序列从起始密码子(ATG)到终止密码子(TAA)完全被hLYZ基因组序列精确置换的目的。结论:通过连续3步缺口修复构建杂合mWAP-hLYZ基因座乳腺表达载体,为乳腺生物反应器高效表达人溶菌酶提供了可行的思路和方法。 相似文献
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目的:构建一个牛αS1酪蛋白调控序列指导人溶菌酶(hLYZ)基组序列的杂合基座.方法:采用本实验室发明的连续3步缺口修复技术.将6个无痕连接的同臂插入以 pBR322为载体的骨架中,构成能进行3次连续基抓捕的载体,利用 Red 同重组系统介导的缺口修复技术,分别抓捕牛αS1酪蛋白3'端调控序列(9 kb)、hLYZ 基座序列(5 kb)、牛αS1酪蛋白5'端调控序列(20 kb),使这3个基片段自动无痕地连接在基抓捕载体上,形成牛αS1酪蛋白-hLYZ 杂合基座.结果:实验经过 PCR 扩增、限制性内切酶酶切验证和序列测定,验证了 hLYZ 的基组序列对牛αS1酪蛋白编码基组序列的精确置换.结论:这种修复技术为乳腺生物反应器高效表达大载体的制备提供了可行的思路及方法. 相似文献
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