胰高血糖素样肽1或其类似物体外生物活性检测方法的建立

目的:通过对不同活性检测方法的综合比较,筛选最适的胰高血糖素样肽1(GLP-1)或其类似物的体外活性检测方法,为GLP-1类似物的体外生物活性检测奠定基础。方法:以GLP-1作为阳性药物,用MTT方法检测其对RIN-m-5F、MIN6细胞增殖的影响;用ELISA方法检测其对INS-1、MIN6细胞胰岛素分泌量的影响;用ELISA方法检测其对BHK-GLP-1R细胞cAMP分泌水平的影响。通过对上述方法的综合比较,筛选出最适的活性检测方法。结果:GLP-1对细胞增殖的影响实验结果并不显著,对胰岛素分泌量影响的实验效果明显,对cAMP分泌水平的实验无明显效果。结论:ELISA检测GLP-1或其类似物对MIN6细胞胰岛素分泌量实验可用于GLP-1或其类似物的体外活性检测。     

一种原代肺上皮细胞体外培养方法

目的:建立一种操作简便、重复性好的体外培养BALB/c小鼠原代肺上皮细胞(AEC)的方法,探究不同发育阶段小鼠AEC中柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)表达量的变化,及其对小鼠原代AEC贴壁的作用。方法:手术获取小鼠肺组织,机械法剪碎肺组织,PBS缓冲液清洗肺组织块数次去血,联合使用链霉蛋白酶和胶原酶Ⅰ消化、分离肺组织块获得单细胞悬液,差速离心逐步清除其他种类的细胞,达到纯化AEC的作用。细胞在Ⅰ型鼠尾胶原蛋白包被过的细胞板中培养,光学显微镜下观察不同发育阶段AEC贴壁、生长状态;免疫荧光法鉴定AEC,检测AEC中CAR的表达量。结果:体外获得不同发育阶段BALB/c小鼠的原代AEC;胎鼠、幼鼠AEC贴壁并开始增殖所需时间较成体鼠短;胎鼠及幼鼠AEC中CAR的表达量明显较成体鼠高。结论:建立了稳定可重复的分离、纯化、体外培养小鼠原代AEC的方法,证明了AEC中的CAR可以促进原代AEC贴壁,为完善原代细胞培养方法提供了科学依据。     

以大肠杆菌为底盘细胞构建XylR-Pu线路检测2,4,6-三硝基甲苯

目的:恶臭假单胞菌中的TOL质粒上的XylR-Pu是经典的甲苯代谢通路,在甲苯类化合物存在时,调控蛋白XylR可以特异性的激活Pu启动子,进而启动相应甲苯代谢通路的表达。基于合成生物学的思想,优化设计此通路并导入遗传背景清楚、操作简单的大肠杆菌中构建全细胞生物传感器,用于检测环境污染物2,4,6-三硝基甲苯(TNT)。方法:以pETDuet-1为载体骨架,构建了XylR-Pu基因线路,并以绿色荧光蛋白GFP为报告分子,GFP的荧光值可以指征结合诱导剂后的XylR蛋白对Pu启动子的诱导强度,并在基因线路中加入四串联终止序列来降低背景值。最后对XylR蛋白的信号识别区进行连续易错PCR,构建随机突变体文库,从中筛选具有更高感应强度、更好灵敏度及特异性的调控蛋白。结果:四串联终止序列可有效降低XylR-Pu通路的背景值,随机突变体文库中筛选出的生物元件eX0-4,对TNT表现出良好的感应强度、灵敏度及特异性。结论:XylR蛋白在大肠杆菌中对硝基甲苯响应不明显,但筛选得到的突变蛋白eX0-4,为后续生物传感器的更深层次地开发提供了优良的元件储备。另外,利用易错PCR构建随机突变体文库从中筛选发挥预定功能的突变蛋白质也可成为挖掘生物元件的一种通用方法。