肿瘤血管导向性干扰素IFN-α2a-NGR与5-氟尿嘧啶联合应用对A549细胞增殖的影响

目的:观察重组蛋白肿瘤血管导向性干扰素IFN-α2a-NGR与化疗药物5-氟尿嘧啶联合使用在体外对人非小细胞肺癌细胞株A549的作用,为IFN-α2a-NGR的临床实验设计提供实验依据。方法:不同浓度的肿瘤血管导向性干扰素IFN-α2a-NGR、5-氟尿嘧啶单独及联合作用于细胞株A549,通过MTT法检测单药及联合用药对细胞增殖的影响,经AnnexinⅤ-FITC细胞凋亡检测试剂盒染色、流式细胞术检测细胞凋亡情况,荧光显微镜观察药物作用的细胞形态。结果:IFN-α2a-NGR与5-氟尿嘧啶联合作用于A549细胞株时,其细胞增殖抑制率、细胞凋亡率均较单独作用时高,具有统计学显著性差异(P<0.05);荧光显微镜观察可见药物作用后细胞形态改变。结论:肿瘤血管导向性干扰素IFN-α2a-NGR与5-氟尿嘧啶联合使用具有协同抑制肿瘤细胞增殖的作用。     

LAT1在大肠癌中的表达及其与预后的相关性研究

目的:研究L型氨基酸转运子1(LATl)在大肠癌组织中的表达及其与大肠癌患者临床病理特征和预后的关系.方法:用免疫组织化学方法检测大肠癌组织和癌旁正常大肠组织中LAT1的表达水平,分析大肠癌组织中LAT1的表达与大肠癌患者临床病理特征和术后生存的关系.结果:LAT1在大部分大肠癌组织中表达呈阳性,阳性率为87.1％(81/93),而在癌旁正常大肠组织的阳性表达率仅为16.13％(15/93),显著低于大肠癌组织(P＜0.05).LAT1的表达水平与大肠癌患者的临床病理参数间无显著相关性,与患者的总生存期之间的相关性也无统计学意义(P＞0.05),但LAT1高表达的患者无进展生存期较低表达患者显著缩短(Log-rank P=0.046),单因素Cox回归分析表明LAT1高表达是影响大肠癌术后复发转移的潜在危险因素[HR=2.338(95％CI:0.990-5.523),P=0.053].结论:LAT1的表达可能作为判断大肠癌患者术后复发转移风险的参考指标,LAT1高表达的大肠癌患者术后复发转移风险较高.     

基于电镜和免疫组化的线粒体数目标志物评估肝癌的初步研究

目的:研究线粒体数目与肝癌生长的相关性。方法:利用电子显微镜技术定量肝癌组织中线粒体数目,利用免疫组织化学技术评估肝癌组织中的线粒体标志物COX Ⅳ及HSP60表达水平,分析电镜肝癌线粒体定量结果与COX Ⅳ及HSP60表达量之间的相关性,并比较肝癌中线粒体数目、COX Ⅳ及HSP60表达量与肝癌直径之间的关系。结果:与癌旁相比,肝癌组织中线粒体数目(P0.001)、COX Ⅳ及HSP60的表达量显著降低(P=0.0417,P=0.0290)。COX Ⅳ及HSP60表达水平与线粒体数目无显著相关(r~2=0.009,P=0.5468;r~2=0.056,P=0.1396)。线粒体数目与肿瘤直径显著负相关(r~2=0.1086,P=0.0434),COX Ⅳ及HSP60表达量与肿瘤直径无显著相关(r~2=0.0251,P=0.3287;r~2=0.0461,P=0.1830)。结论:线粒体数目是潜在的肝癌生长标志物。但常用的线粒体定量分子HSP60与COX Ⅳ并不能准确定量肝癌线粒体。     

基于新一代测序技术的mtDNA突变检测方法学的建立

目的:大量研究证实线粒体DNA(mtDNA)突变与肿瘤发生及进展密切相关,但使用传统测序方法难以高通量、高精确度的检测mtDNA突变,为此本研究建立了基于新一代测序技术的mtDNA突变检测方法.方法:提取肝癌患者癌、癌旁组织以及外周血细胞总DNA,利用PCR技术对线粒体基因组进行富集并对PCR产物进行平末端、粘性末端连接或对PCR引物进行氨基修饰,构建mtDNA测序文库.经Illumina HiSeq 2000平台测序后利用生物信息学方法与人类mtDNA参考序列进行比对,并进行测序数据分析.结果:通过对不同质量基因组DNA进行评估后,发现三对引物法适用于大部分DNA样本的mtDNA富集.进一步我们发现PCR引物的氨基修饰可显著提高测序数据覆盖均一性,降低测序成本.结论:本研究利用新一代测序技术通过对线粒体DNA富集方法以及测序覆盖度均一性进行优化,建立了一套灵敏、特异、高通量的mtDNA突变检测策略,为mtDNA突变与疾病研究提供了新方法.     

NAMPT 真核表达载体构建及其对肝癌细胞增殖的影响

目的:为探索烟酰胺磷酸核糖基转移酶(NAMPT)对肝癌细胞增殖的影响,构建pc DNA3.1(+)-NAMPT真核表达载体。方法:以正常肝细胞的c DNA为模板,通过PCR扩增得到NAMPT全长序列,经酶切、连接、转化等步骤构建真核表达载体。重组质粒经酶切鉴定及测序验证后,用脂质体转染法转染肝癌细胞MHCC-97H和正常肝细胞HL-7702,免疫印迹检测NAMPT蛋白表达情况;WST实验检测过表达NAMPT后对MHCC-97H和HL-7702增殖的影响。结果:真核表达载体pc DNA3.1(+)-NAMPT构建成功,转染HL-7702和MHCC-97H细胞后,NAMPT蛋白表达水平较空白组分别升高了83%和180%;过表达NAMPT可促进细胞增殖,而抑制NAMPT活性后,细胞增殖被抑制(P0.001)。结论:成功构建了真核表达载体pc DNA3.1(+)-NAMPT,并发现NAMPT表达水平与细胞增殖密切相关,为进一步探索NAMPT表达在肝癌细胞增殖的分子作用机制和筛选新的肿瘤药物靶点奠定了基础。     

一种新的线粒体基因组DNA捕获探针的制备及初步应用

目的:建立新的线粒体基因组DNA杂交捕获探针制备方法并用进行初步应用。方法:通过PCR技术扩增特异线粒体DNA片段,并与生物素偶联,最后与标记磁珠的亲和素混合获得捕获探针。并自行制备的线粒体基因组DNA文库捕获探针与肝癌全基因组测序文库进行液相杂交。分离捕获产物后PCR扩增并进行测序分析。结果:成功建立了线粒体基因组杂交捕获探针制备方法并成功分离线粒体基因组DNA;对测序数据的分析显示:90%以上测序数据来自线粒体基因组DNA,且覆盖率达到100%,且均一性良好。检测到的同质性变异位点数量和异质性变异位点数量与全基因组测序数据产生的结果接近(P=0.9152,P=0.8409)。结论:新方法制备的线粒体基因组DNA杂交捕获探针可以从全基因组文库中高效捕获线粒体基因组DNA测序文库。     

降低mRNA翻译起始区的稳定性原核非融合表达HAb18GEF

为在大肠杆菌中非融合表达肝癌相关抗原HAb18G胞外区片段（HAb18GEF）,将HAb18GEF基因的cDNA插入原核表达载体pET21a+。通过计算机辅助设计,对重组的HAb18GEF/pET21a+的mRNA翻译起始区（TIR）的二级结构和密码子偏性同时进行预测。结果发现其存在稳定的茎环结构和许多稀有密码子。通过优化二级结构和优化密码子偏性二种策略分别来降低HAb18GEF/pET21a+的mRNA翻译起始区（TIR）的稳定性。在不改变氨基酸序列的前提下,利用密码子的简并性,通过非连续定点突变实现这两种优化。将突变前后的重组子经酶切鉴定和测序验证后,转化感受态JM109DE3宿主菌后,随机挑菌37℃下用IPTG诱导表达。SDSPAGE、间接ELISA、Western blot 和细胞分级分离法分析这些重组子的诱导表达情况。RNA dot blot对比分析优化前后目的基因mRNA的量。结果证明,成功地构建了HAb18GEF/pET21a+及其二种优化突变体。仅优化TIR区二级结构或仅优化TIR区密码子偏性均能实现HAb18GEF蛋白的非融合表达,而未优化的重组子不表达任何HAb18GEF。非融合表达产物在大肠杆菌中主要以包涵体形式存在,高达293%。由于过表达和细胞渗漏,培养基和周质腔中也可检测到少许的HAb18GEF。优化二级结构和优化密码子偏性二种策略的HAb18GEF的非融合表达量基本相同。优化前后HAb18GEF转录的mRNA量没有差别。这些结果表明,降低mRNA翻译起始区的稳定性可实现肝癌相关抗原HAb18G胞外区片段在大肠杆菌中的非融合表达。     

NDRG2基因启动子甲基化与肺腺癌细胞中mRNA表达相关性的实验研究

目的:探讨肺腺癌细胞中NDRG2基因启动子甲基化状态及其与基因表达的关系。方法:甲基化焦磷酸测序技术检测启动子区域甲基化状态,荧光定量PCR技术检测不同药物浓度下培养细胞中NDRG2基因mRNA的表达水平,分析启动子区域甲基化与基因表达之间的关系。结果:在体外培养细胞中检测到NDRG2基因启动子区域呈现不同程度的甲基化,甲基化频率分别为肺癌A549细胞71.8%、GLC-82细胞86.1%、人脐静脉内皮ECV-304细胞36.8%、胃上皮GES-1细胞42.9%。NDRG2基因mRNA表达与其启动子甲基化程度成反比,甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)作用于细胞后,A549和GLC-82细胞中NDRG2基因的mRNA转录明显上调,至72 h差异显著(P0.05)。结论:肺腺癌细胞中NDRG2基因启动子CpG岛存在高甲基化,甲基化程度与该基因的表达具有负相关性,5-Aza-CdR能在一定程度上提高NDRG2的转录水平。     

一种含有端粒重复序列非编码RNA的发现及最新研究进展

端粒是染色体末端的特化结构,由简单呈串联线性排列的核酸重复序列及相关蛋白质组成。其核酸序列具有高度的保守性,均富含GC。在人类为TTAGGG的高度重复序列具有维持基因组完整性的作用。端粒功能异常会导致染色体失去稳定性,促进肿瘤的发生和发展。以往认为端粒附近区域不具有转录活性,但最近在Science杂志上Azzalin等首次报道了该区域可以转录一种非编码RNA,即端粒RNA(telomeric RNA)。该分子具有特殊的UUAGGG重复序列,在调控端粒长度和端粒酶活性上具有重要作用,在发育、衰老和肿瘤发生发展等研究中已成为热点。该文将对近期有关端粒RNA的研究进展予以综述。