弱精子症精子中miRNAs特异表达及潜在致病靶点的分析

摘要 目的：弱精子症可见于40%的不育男性,其特征是精子活力低下。微小RNA（MicroRNAs,miRNAs）在精子发生中发挥重要作用,但关于精子中miRNAs在弱精子症中的作用知之甚少。本研究试图初探miRNAs在弱精子症的分子机制。方法：收集了重度弱精子症患者和健康男性的精子样本,采用高通量序列技术来识别差异表达的miRNAs,并对差异显著的miRNAs进行生物信息学分析。通过qRT-PCR 证实了2个特异性改变的 miRNA及其靶基因表达情况。结果：重度弱精子症患者与正常男性相比,共有146 个miRNAs（P＜0.05; |log2 Fold Change|＞1）发生改变,其中表达上调的52个,下调的94个;预测上下调幅度最显著的前10个miRNAs 的靶基因,同时在miRDB和TargetScan 数据库存在的靶基因共有1407个。富集分析结果显示,miRNAs的靶基因富集于精子细胞的生物过程,还参与精子细胞的氧化代谢、刺激反应、增殖和分化以及凋亡等生物过程。通路分析显示,靶基因可能参与细胞自噬、细胞衰老、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、HIF-1信号通路、mTOR信号通路等。其中,在弱精子症精子中特异性上调的hsa-miR-371a-5p和hsa-miR-2355-5p,预测靶基因分别为自噬效应蛋白Beclin1和线粒体内膜蛋白抑素2（prohibitin2,PHB2）,二者直接参与线粒体自噬过程。qRT-PCR结果显示随着精子活力的降低,精子中hsa-miR-371a-5p和hsa-miR-2355-5p的表达量升高。结论：本研究发现弱精子症患者精子中特异性失调的miRNAs及其靶基因,为后续深入研究低活力精子中miRNAs参与调控线粒体自噬功能的机制提供新思路和理论依据。     

ULK1复合物在细胞自噬中的作用

ULK1复合物在细胞自噬的启动中发挥重要作用,其作用包括接收细胞营养状态信号,将下游Atg蛋白招募到自噬体形成部位,以及管理自噬体形成。目前研究工作表明在不依赖营养和能量状态下,ULK1复合物也有可能被激活。在这篇文章综述了ULK1复合物是如何被不同的信号调控,以及ULK1复合物是如何调控细胞自噬机制的其他因素。     

基于数据挖掘分析ATP1A1基因在肾透明细胞癌中的表达及意义

目的:通过数据挖掘分析ATP1A1在肾透明细胞癌中的表达及意义。方法:通过Oncomine数据库检索关于ATP1A1的mRNA信息,采用The Human Protein Atlas分析ATP1A1蛋白在正常肾组织和肾透明细胞癌中表达情况,GEPIA网站中TCGA数据对ATP1A1低表达的肾透明细胞癌患者进行生存分析,Meth HC数据库分析ATP1A1甲基化水平和蛋白相互作用,利用String-DB数据分析ATP1A1与上下游蛋白的相互作用。结果:肾透明细胞癌(Clear cell Renal Cell Carcinoma,cc RCC)组织中ATP1A1的mRNA表达水平较正常对照组明显降低。免疫组化结果证实ATP1A1蛋白质表达变化与mRNA相似。TCGA数据中得出ATP1A1低表达患者的总体生存期明显短于高表达组患者。此外,ATP1A1基因启动子区在肾透明细胞癌中的甲基化水平明显高于正常肾组织中。同时,ATP1A1与ATP1B1、FXYD2、ATP1B2等蛋白可能存在相互作用。结论:大数据分析结果表明ATP1A1在肾透明细胞癌中低表达,并与其发生发展相关,可能作为其潜在的治疗靶点。     

肾透明细胞癌Caki-1细胞系差异表达基因的生物信息学分析

目的比较肾透明细胞癌Caki-1细胞系与正常肾上皮细胞系ASE-5063中的差异表达基因（DEGs）,寻找潜在的肾透明细胞癌特异性分子标志物。 方法利用GEO数据库自带的GEO2R在线分析工具分析基因芯片GSE78179,将筛选出的DEGs分别导入Metascape、STRING以及Cytoscape进行综合分析并筛选出核心基因。最后使用FunRich等软件对筛选出的核心基因进行GO和KEGG富集分析。 结果共筛选出562个DEGs,其中上调基因345个,下调基因217个。进一步使用MCODE筛选出36个关键基因,GO功能分析发现这些基因与细胞粘附分子活性、趋化因子活性、细胞通讯和信号转导等密切相关;KEGG通路富集结果则表明差异基因主要集中在趋化因子信号通路、TNF信号通路以及NF-κB信号通路等多种与肿瘤相关的通路上。 结论运用生物信息学方法筛选出肾透明细胞癌Caki-1细胞系中DEGs,其中数个核心基因广泛参与多种肿瘤的病理进程,但尚未在肾透明细胞癌有相关研究报道,提示其可能是治疗肾透明细胞癌的潜在靶点。     

肿瘤相关间充质干细胞及其靶向治疗的研究进展

间充质干细胞（MSCs）存在于许多组织中,在组织出现损伤时会迁移到受伤部位进行修复。而癌症可以被看作是"永远不会愈合的伤口",在肿瘤微环境中MSCs会被持续募集成为肿瘤微环境的一部分。最近出现了一种肿瘤相关间充质干细胞（TA-MSCs）,它可以激活肿瘤的发生,促进肿瘤的发展与转移。本文讨论了MSCs与TA-MSCs之间的关系;探讨对TA-MSCs的最新认识及其调节癌细胞生存、增殖、迁移与耐药能力。而且,讨论了把TA-MSCs作为癌症治疗上游或者下游的靶点或者用MSCs做载体来传递癌症因子将会发展为癌症治疗的新手段。     

间充质干细胞促进Luminal B型乳腺癌细胞生长增殖及其分子机制

目的分析人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)对Luminal B型乳腺癌细胞生长增殖的影响,并初步探讨其可能的分子机理。方法绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶共表达慢病毒感染人Luminal B型乳腺癌细胞BT474,并经嘌呤霉素筛选两周后,于荧光显微镜下观察GFP的表达情况,IVIS Kinetic成像系统拍照以观察和记录慢病毒感染后BT474细胞荧光素酶的表达情况;荧光显微镜下直接观察,结合MTS实验分析hUC-MSCs共培养或其浓缩上清处理对GFP和荧光素酶共表达BT474细胞生长增殖的影响;Western blot法检测hUC-MSCs浓缩上清处理对BT474细胞Akt和MAPK信号通路激活情况以及下游细胞周期调控蛋白Cyclin D1表达的影响;常规RT-PCR法检测hUC-MSCs中NRG-1、NRG-2、IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ和EGF等配体的表达。荧光素酶表达强度与细胞数量的相关性经由Excel软件行统计学分析,MTS实验数据则经由SPSS13.0统计软件行统计学分析。结果荧光显微镜和IVIS Kinetic成像系统的观察结果分别证实,GFP和荧光素酶经慢病毒载体系统的介导可在BT474细胞中成功地共表达,且荧光素酶的表达强度与细胞数量呈直线相关。MSCs共培养或其浓缩上清处理均可显著促进Luminal B型乳腺癌细胞BT474的生长增殖,其细胞存活比例分别为各自对照组的148.06%(P0.005)和147.99%(P0.001);MSCs浓缩上清处理同时激活BT474细胞内Akt和MAPK信号通路,并上调细胞周期调控蛋白Cyclin D1表达。此外,RT-PCR结果显示,hUC-MSCs中NRG-1和EGF的mRNAs水平呈高表达,而NRG-2、IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ等配体的mRNAs表达也可见。结论 MSCs可通过表达并分泌NRG-1等配体,从而激活Luminal B型乳腺癌细胞BT474的下游Akt和MAPK信号转导通路以上调细胞周期调控蛋白Cyclin D1的表达,进而促进其生长增殖。     

TAT-MafA融合蛋白诱导小肠细胞系IEC-6表达胰岛素

借助蛋白质转导技术,利用胰岛β细胞转录因子MafA诱导小肠细胞系IEC-6表达胰岛素,为糖尿病的治疗提供新的方法。将TAT基因与MafA基因一起插入p32a（＋）载体中,构建TAT—MafA融合蛋白原核表达载体,转化BL21获得表达菌株,经IPTG诱导和Ni柱亲和层析纯化TAT-MafA融合蛋白,用1μM浓度的该融合蛋白孵育IEC-6细胞12h和24h后,分别进行进胞检测和胰岛素表迭检测。实验结果表明,细胞免疫荧光和Western-blot方法检测到经TAT—MafA融合蛋白作用12h后的IEC-6细胞中有该蛋白,并经细胞免疫荧光和RT—PCR的方法检测出TAT—MafA作用24h后的IEC-6细胞中有胰岛素的表达。因此,TAT—MafA融合蛋白可以高效进入小肠细胞系IEC-6细胞,并且进胞后仍保持MafA原有的生物学活性,能启动胰岛素基因的表达,诱导IEC-6成为胰岛素表达细胞。     

人尿源干细胞的提取和鉴定

目的从正常人尿液中分离得到具有增殖和分化能力的人尿源干细胞(h USC)。方法收集16例健康成人新鲜尿液,分离培养得到贴壁细胞,显微镜观察拍照。WST-1检测并绘制细胞生长曲线。流式细胞术分析细胞表面分子表达率。成骨和成脂诱导培养基诱导h USC分化。结果采用优化的细胞培养基得到12株具有较快增殖能力的h USC。分离的细胞中表达CD13、CD29、CD73、CD105的细胞数目均大于97﹪,表达CD90的细胞数目不足50﹪,表达造血系表面抗原CD14、CD19、CD34、CD45,内皮细胞表面抗原CD31以及HLA-DR的细胞数目均小于1﹪。h USC经诱导可分化成为骨和脂肪细胞。结论采用本研究自建培养体系可培养得到形态单一、具有较强增殖分化能力的人尿源干细胞。