SARS冠状病毒NS融合蛋白的重组表达纯化与免疫学性质分析(英文)

刺突蛋白(S)和核心蛋白(N)是SARS冠状病毒的主要结构蛋白.在病毒细胞受体结合和病毒包装过程起重要作用.重组融合表达这2种蛋白具有较高的诊断学价值.对SARS病毒N蛋白和S蛋白氨基酸序列进行计算机分析,选择含有优势抗原表位的N蛋白1～227位氨基酸片段和S蛋白450～650位氨基酸片段,采用序列重叠延伸策略(sequenceoverlappingextension,SOE)构建编码N1227LinkerS450650新型融合蛋白的基因片段,导入原核表达载体,实现融合蛋白在大肠杆菌的高效表达.利用组氨酸标签亲和层析的方法纯化,获得高纯度的融合蛋白.对该融合蛋白的结构特征模拟分析的结果显示,其免疫化学性质均无显著改变.采用ELISA和Western印迹方法对其识别SARS冠状病毒特异性抗体的能力进行初步鉴定,显示该融合蛋白具有较好的抗原性和特异性,可有效特异性地检测恢复期SARS病人血清中抗SARS冠状病毒结构蛋白的抗体,可以作为SARS冠状病毒感染的辅助诊断手段.     

神经纤毛蛋白-1的原核表达及兔抗小鼠神经纤毛蛋白-1抗体免疫学活性的研究

目的:在原核系统中分段表达神经纤毛蛋白-1(Nrp1);将纯化的蛋白免疫家兔后获得特异的抗体,并将其应用于检测组织和细胞中Nrp1分子的表达。方法:提取BALB/c胎鼠脑组织总RNA,通过RT-PCR分段扩增获得Nrp1基因片段,将PCR产物插入表达载体pET28a( ),获得含5个Nrp1基因片段的重组质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导蛋白表达并纯化;将纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔获得针对目的蛋白的特异性多克隆抗体;利用Nrp1特异性多抗检测胎鼠脑组织和HeLa细胞中Nrp1的表达。结果:在原核系统中分段表达了Nrp1蛋白,通过Ni-NTA纯化了Nrp1蛋白片段;纯化的Nrp1蛋白免疫新西兰大白兔获得了具有免疫活性的多抗;兔抗小鼠Nrp1特异性多抗可用于检测组织、真核细胞中Nrp1的表达。结论:应用原核系统成功地表达了Nrp1蛋白,兔抗小鼠Nrp1特异性多抗可用于免疫学检测Nrp1分子的表达。     

血小板生成素双体分子的融合构建、原核表达及其分子结构特性预测

目的：为了研制更稳定、高效、低毒的血小板生成素(TPO),拟设计构建TPO的双体分子(T-T)并在原核中表达,同时预测其融合蛋白的分子结构特性。方法：采用分子克隆方法分别构建TPO单体分子与双体分子的原核表达载体pFT32/TPO和pET32／T-T,并在大肠杆菌中进行表达,以Western blot鉴定表达产物;用生物信息学方法DS Gerie1.1和ProtScale软件,对该融合蛋白的结构特征如电点、柔性、抗原性及亲水性等进行模拟分析。结果：成功构建TPO双体分子pET32／T-T的原核表达载体,并经NcoⅠ和NotⅠ双酶切电泳及测序证实。通过转化origami^TM(DE3)感受态茵及IPTG诱导获得高效表达,其产量在40％以上;Western blot显示表达产物能与抗TPO单克隆抗体特异性结合。对T—T双体分子融合蛋白的结构特性预测表明,其融合蛋白中的两个TPO单体分子等电点、抗原性及亲水性均无显著改变,接头处具有高柔性。与TPO的原始序列相比,T-T的一级结构中有2个氨基酸发生改变,在接头(L)后插入一段34个氨基酸的新序列(N)。此序列具有一定的抗原性和亲水性,呈现B片层结构。结论：本研究所构建表达的TPO单体和T-T双体分子均可在大肠杆菌中获高效表达,T-T双体分子的结构预测符合设计要求,为进一步研究新型T-T双体分子融合蛋白的生物学特性提供了基础。