结核分枝杆菌硫醇乙酰基转移酶基因敲除株的构建及其生物学特性分析

为探索硫醇乙酰基转移酶(mycothiol acetyltransferase,MshD)在结核分枝杆菌中的生物学特性,本实验利用噬菌体为载体的同源重组技术,构建结核分枝杆菌mshD基因敲除株、mshD基因回补株,用实时定量聚合酶链反应(real time-quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)对所构建的菌株进行验证。分别收集H37Ra野生株、mshD基因敲除株、mshD基因回补株对数生长期菌液各5 mL, 离心收集菌体并培养,以观察菌落形态、生物膜形成及生长曲线测定;用5 mmol/L H₂O₂、0.05% SDS,50 ℃热激及低氧条件下分别处理基因敲出菌株和野生菌株,将菌液进行10倍梯度稀释,培养4～6周后检测抗胁迫能力并计算存活率。结果显示, 与野生株H37Ra相比,mshD基因敲除株菌落褶皱减少且菌落偏小,生长趋势较为缓慢;生物膜形成所需时间增长且褶皱明显减少;抗逆能力下降,存活率略低于野生株和回补株。揭示了mshD基因对结核分枝杆菌的生长具有重要作用,为进一步揭示该基因的功能和作用机制奠定了基础。     

结核分枝杆菌EF4敲除菌株的构建

EF4是一个由 lepA 基因编码的与蛋白质翻译密切相关的延伸因子,在细菌中高度保守,但其确切功能和分子机制尚不清楚,在结核分枝杆菌中的功能至今未见报道。为探索EF4在结核分枝杆菌中的功能,需构建一株结核分枝杆菌 lepA 基因敲除株。本研究以结核分枝杆菌H37Ra全基因组DNA为模板,设计并通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增 lepA 基因左、右臂,连接到p0004S质粒,构建同源重组质粒p0004S-Δ lepA 。然后,通过噬菌体体外包装,将p0004S-Δ lepA 质粒连接到phAE159质粒,构建phAE159-Δ lepA 噬菌体包装质粒。在耻垢分枝杆菌mc 2155中大量扩增噬菌体并受结核分枝杆菌侵染进行同源重组,筛选阳性克隆,从基因组和蛋白质表达水平检测该突变株中 lepA 基因及EF4蛋白表达。PCR结果显示,敲除株基因组中 lepA 基因已被潮霉素抗性基因成功替换,蛋白免疫印迹结果显示该敲除株中无EF4表达,表明其为成功构建的Ra Δ lepA 。生长曲线分析显示,正常培养条件下,结核分枝杆菌野生株与敲除株生长趋势一致。敲除株与野生株在菌落形态上有一定差异,相比于野生株,Ra Δ lepA 菌落颜色发黄,凸起偏厚,生长过程中生物膜皱褶较少。耐胁迫能力分析显示,与野生株相比,Ra Δ lepA 耐热、抗去垢剂、抗氧化能力无显著差异,但耐酸性环境能力明显增强。本研究利用噬菌体介导的重组法成功构建了结核分枝杆菌 lepA 基因敲除株,为后续研究结核分枝杆菌EF4的功能提供了重要基础。     

抗结核活性化合物HY-152E的作用靶点分析

抗结核活性化合物HY-152E是本实验室前期获得的具有良好抗结核活性并拥有授权专利（ZL201210088290.0）的小分子化合物（最低抑菌浓度≤0.09 μg/mL）。为深入探索HY-152E的抗结核机制,本研究利用药物亲和反应靶标稳定性（drug affinity responsive target stability,DARTS）技术并结合蛋白质谱技术,分析可能与HY-152E相互作用的结核分枝杆菌潜在靶标蛋白。将结核分枝杆菌H37Ra的菌体蛋白裂解液与HY-152E共同孵育互作,用不同浓度的链霉菌蛋白酶消化30、45、60 min后,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）分离并比较与HY-152E互作前后菌体蛋白耐受蛋白酶消化的差异条带,分别在相对分子质量70 000和45 000~55 000处观察到差异蛋白条带。利用蛋白质谱技术分析差异条带的蛋白信息,共获得86个蛋白信息。结合结核分枝杆菌数据库及蛋白功能信息,最终筛选到9个蛋白可能是HY-152E的抗结核作用潜在靶标。这些潜在靶点的确定,为后续研究HY-152E的抗结核分子机制奠定了基础。     

耻垢分枝杆菌中反式翻译报告体系的构建

细菌在翻译过程中,mRNA受到损伤(如缺失终止密码子)时会使翻译提前终止,导致核糖体熄火,细菌自身会启动核糖体拯救途径。由tmRNA-SmpB介导的反式翻译系统是结核分枝杆菌中的核糖体拯救途径,对结核分枝杆菌的生长繁殖有重大影响。为探究分枝杆菌中反式翻译途径的启动及其功能特点,本研究选取耻垢分枝杆菌为实验菌株,分别以mCherry和egfp作为报告基因,通过在报告基因3′端添加大肠埃希菌终止子序列,构建能在菌体中反映反式翻译表达的报告体系,并初步探究该体系中报告基因的动态表达特点。结果显示,相比正常表达mCherry的对照菌株,实验菌株中表达的错误mCherry蛋白很快被水解,菌体颜色均明显浅于前者,增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)定量检测数据也显示错误EGFP水平显著低于正常表达的EGFP水平,表明两种反式翻译报告体系均构建成功。报告基因的动态表达数据显示,蛋白出现翻译异常时,耻垢分枝杆菌可在蛋白翻译过程中快速启动反式翻译途径,并于40～45h将不成熟错误蛋白完全水解。本研究构建的反式翻译报告体系可为后续开展分枝杆菌反式翻译途径的功能研究及抗结核药物筛选提供帮助。     

应用CRISPRi技术敲低耻垢分枝杆菌异柠檬酸脱氢酶基因

成簇的规律间隔的短回文重复序列干扰(clustered regularly interspaced short palindromic repeat interference,CRISPRi)是一种新型转录抑制技术,该系统包含RNA介导的DNA内切酶dCas9和针对目的基因的特异性单向导RNA(single guide RNA,sgRNA),通过形成DNA识别复合物特异性识别相应DNA序列以抑制目的基因的转录。异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,ICD)是三羧酸循环中的关键代谢酶,在分枝杆菌的碳代谢过程中发挥重要作用。本研究利用CRISPRi高效抑制分枝杆菌特定基因表达的方法构建耻垢分枝杆菌icd敲低(icd knockdown,ICD-KD)株。定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)和蛋白免疫印迹检测结果显示,耻垢分枝杆菌中icd转录水平与ICD蛋白表达水平显著下降,表明采用CRISPRi技术成功构建了耻垢分枝杆菌ICD-KD株。进一步研究ICD-KD株的生长情况,测定其在固体培养基点板及液体培养基中的生长曲线,结果均显示ICD-KD株生长速率明显减慢,同时菌体内ICD酶活显著降低,提示ICD对分枝杆菌的生长存活起重要作用。本研究使用CRISPRi技术快速构建了分枝杆菌必需基因的敲低菌株,为后续研究分枝杆菌ICD在碳源代谢通路中的功能和碳通量流向调控机制提供了重要基础。