建立转酮酶酶活测定方法及应用

摘要：目的 转酮酶是非氧化磷酸化戊糖途径中的关键酶。5-磷酸木酮糖是分析测定转酮酶酶活性的底物,然而因该底物难以化学合成,生产成本高,从而导致厂家停止生产,目前市场上无法得到。因此有必要建立起新的转酮酶酶活测定方法。方法 （1）将酿酒酵母的木酮糖激酶基因（XKS1）克隆于pET30a载体。（2）纯化木酮糖激酶。（3）建立酶偶联反应,以木酮糖为底物,将其转化为5-磷酸木酮糖,用于转酮酶酶活的测定。结果 （1）成功地将XKS1基因克隆于pET 30a得到质粒pXZ-X004。（2）质粒pXZ-X004诱导表达产生C端His-tag标签的XK,用Ni柱分离得到纯化的木酮糖激酶(XK)。（3）纯化的XK活性为21.0 U/mg protein,当用12.5%的甘油保存于?80 ℃环境1个月,仍有74%的活性。（4）用纯化的XK建立了转酮酶（TK）酶活测定新方法,当TK酶活低至0.00875 U时仍能够利用新方法检测。结论 本实验通过克隆和表达XKS1基因,成功地建立了TK酶活性测定的新方法,并应用于木糖代谢工程菌株TK酶活的测定,为医学和生态学领域中TK酶活的分析奠定了基础。     

普萘洛尔对映异构体诱导HUVEC细胞的蛋白质表达谱差异

手性药物只能通过严格的手性识别才能选择性地与特定生物大分子相互作用,在药动学、药效学等方面上表现出手性特征.以非选择性β肾上腺素能受体阻滞剂普萘洛尔（PRO）的对映异构体R(+)/S(-)-PRO为模型药物,分别作用于人脐静脉内皮细胞（HUVEC）,提取全细胞蛋白质,经双向电泳、MALDI-TOF-MS、SWISSPROT数据库分析鉴定差异表达蛋白质;共筛选出22个差异表达蛋白质点,鉴定了HSP86、HSP84、GRP75、KLC18、KBTB2、TGM2、GBLP、GCNT2、RAB36、KLH34等10种蛋白质.研究表明,PRO对映异构体可引起广泛的基因表达改变,涉及信号分子、代谢酶、骨架蛋白、伴侣蛋白等,且具有显著的手性特征,这可能与PRO显著的手性生物学特征有紧密联系,但仍需开展进一步深入研究,以明确产生PRO手性生物学特征的多种途径和机制.蛋白质组学技术为深入了解药物的手性生物学特征及其作用机制提供了新的思路和策略,对手性药物开发和临床合理用药有着重要的意义.     

建立转酮酶酶活测定方法及应用

目的转酮酶是非氧化磷酸化戊糖途径中的关键酶。5-磷酸木酮糖是分析测定转酮酶酶活性的底物,然而因该底物难以化学合成,生产成本高,从而导致厂家停止生产,目前市场上无法得到。因此有必要建立起新的转酮酶酶活测定方法。方法(1)将酿酒酵母的木酮糖激酶基因(XKS1)克隆于pET30a载体。(2)纯化木酮糖激酶。(3)建立酶偶联反应,以木酮糖为底物,将其转化为5-磷酸木酮糖,用于转酮酶酶活的测定。结果 (1)成功地将XKS1基因克隆于pET 30a得到质粒pXZ-X004。(2)质粒pXZ-X004诱导表达产生C端His-tag标签的XK,用Ni柱分离得到纯化的木酮糖激酶(XK)。(3)纯化的XK活性为21.0U/mg protein,当用12.5%的甘油保存于-80℃环境1个月,仍有74%的活性。(4)用纯化的XK建立了转酮酶(TK)酶活测定新方法,当TK酶活低至0.008 75U时仍能够利用新方法检测。结论本实验通过克隆和表达XKS1基因,成功地建立了TK酶活性测定的新方法,并应用于木糖代谢工程菌株TK酶活的测定,为医学和生态学领域中TK酶活的分析奠定了基础。     

三七总皂苷对支气管哮喘小鼠气道炎症及气道重建的影响

目的:探讨三七总皂苷对支气管哮喘小鼠气道炎症及气道重建的影响。方法:选择昆明种小鼠24只,将其随机分为三七总皂苷(PNS)治疗组、阳性对照组(哮喘组)和阴性对照组,每组8只。小鼠腹腔内注射氢氧化铝-卵清蛋白悬浊液(OVA-Al(OH)3)进行致敏,致敏完成后用2%卵清蛋白溶液(OVA)雾化激发,在激发前30分钟给药治疗,雾化激发6周。建模完成后,做心肺组织灌流,取左肺固定做HE染色,镜下观察评估气道病理学改变(气道狭窄阻塞率、气道上皮坏死糜烂率、上皮细胞杯状化生率、炎性细胞浸润率及平滑肌增生率);行免疫组织化学染色,用图像分析软件半定量测量转化生长因子-beta1(TGF-β1)的含量;行特殊染色,用图像分析软件测量基底膜厚度;取右肺组织,利用酶联免疫吸附法(ELISA)测定肺组织匀浆白介素-17(IL-17)因子的水平。结果:1各组小鼠经心肺组织灌流后,与哮喘组比较,三七治疗组小鼠的肺部红肿减轻,肺表颜色较正常组略微泛红。2三七治疗组气道狭窄率、上皮细胞坏死率、炎细胞浸润率、平滑肌增生率均显著低于哮喘组(P0.05),但与正常组比较无显著性差异(P0.05)。3三七治疗组气道上皮细胞TGF-β1含量显著低于哮喘组(P0.001),肺组织白介素-17含量降低至哮喘组一半以下(P0.05),与对照组相比均无显著性差异(P=0.94,P=0.23)。4哮喘组、三七组和对照组小鼠的支气管基底膜厚度分别为(0.7893±0.014)、(0.7216±0.016)、(0.5655±0.012)μm,哮喘组显著高于三七组和对照组,均具有显著性差异(P0.05)。结论:三七总皂苷可以有效改善支气管哮喘小鼠的气道重建,并抑制其气道炎性。     

免疫共沉淀结合微流控芯片技术筛选GBLP相互作用蛋白

为了进一步阐明G蛋白β亚基2样1蛋白（guanine nucleotide-binding protein subunit beta 2-like 1,GBLP）在普萘洛尔（propranolol,PRO）生物学效应发生机制中的作用,采用免疫共沉淀法结合液相色谱-芯片-离子阱串联质谱（HPLC-CHIP-IT-MS/MS）系统筛选并鉴定人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）中的GBLP相互作用蛋白.结果表明,有7种蛋白与GBLP存在相互作用,分别为酪蛋白α-S1、酪蛋白α-S2、β酪蛋白、桥粒芯蛋白1前体、α-烯醇化酶、果糖二磷酸醛缩酶C、硫氧还原蛋白过氧化物酶2.这些蛋白的生物信息学检索结果提示,GBLP可能参与了细胞的能量代谢调节和抗氧化机制,与普萘洛尔的生物学效应发生机制密切相关.     

R/S-普萘洛尔的手性吸收动力学研究

目的：采用蛋白质组学研究策略,研究R/S-普萘洛尔（Propranolol,PRO）的手性吸收动力学特征,建立其差异蛋白质图谱。方法：体外培养Caco-2细胞并使之在培养瓶底部融合达80%以上;将含160μmol/L的R-PRO和S-PRO的细胞培养液分别加入到培养瓶中,在培养箱中静置培养4 h;吸弃药液,用刮除法收集培养瓶中的Caco-2细胞,细胞全蛋白提取液裂解并收集Caco-2细胞全蛋白,Bradford法蛋白定量;取100μg全蛋白进行双向电泳,建立R-PRO和S-PRO的差异蛋白质图谱;对差异蛋白进行质谱鉴定和生物信息学检索,根据蛋白功能探讨R/S-普萘洛尔的手性吸收动力学特征。结果：R-PRO和S-PRO的蛋白质图谱差异不明显,对其中的明显差异蛋白质点进行质谱检测,成功鉴定到8个蛋白,分别为：GRP78、GRP75、HSP7C、HSP71、Cytokeratin 8、PIP5K、Ran、Prohibition,经生物物信息学检索,这些蛋白的功能主要涉及细胞的应急反应、能量代谢、生长繁殖等,与药物的主动吸收无直接相关。结论：成功建立了R-PRO和S-PRO的差异蛋白质图谱;R-PRO和S-PRO在蛋白质组学方面虽然存在差异,但这些蛋白与药物的主动吸收无直接相关,推测两药在体外的吸收转运无手性差异,与其它方法的研究结果一致。此外,研究中发现的差异蛋白提示,R-PRO和S-PRO在对细胞的新陈代谢方面有差异,可能与两者在体内的系统清除率的差异相关,这有待进一步研究证实。