建立转酮酶酶活测定方法及应用

摘要：目的 转酮酶是非氧化磷酸化戊糖途径中的关键酶。5-磷酸木酮糖是分析测定转酮酶酶活性的底物,然而因该底物难以化学合成,生产成本高,从而导致厂家停止生产,目前市场上无法得到。因此有必要建立起新的转酮酶酶活测定方法。方法 （1）将酿酒酵母的木酮糖激酶基因（XKS1）克隆于pET30a载体。（2）纯化木酮糖激酶。（3）建立酶偶联反应,以木酮糖为底物,将其转化为5-磷酸木酮糖,用于转酮酶酶活的测定。结果 （1）成功地将XKS1基因克隆于pET 30a得到质粒pXZ-X004。（2）质粒pXZ-X004诱导表达产生C端His-tag标签的XK,用Ni柱分离得到纯化的木酮糖激酶(XK)。（3）纯化的XK活性为21.0 U/mg protein,当用12.5%的甘油保存于?80 ℃环境1个月,仍有74%的活性。（4）用纯化的XK建立了转酮酶（TK）酶活测定新方法,当TK酶活低至0.00875 U时仍能够利用新方法检测。结论 本实验通过克隆和表达XKS1基因,成功地建立了TK酶活性测定的新方法,并应用于木糖代谢工程菌株TK酶活的测定,为医学和生态学领域中TK酶活的分析奠定了基础。     

利用不同启动子控制木糖代谢关键酶基因构建可共代谢葡萄糖木糖重组酿酒酵母

利用不同强度的启动子调控木糖代谢关键酶活性,构建稳定代谢葡萄糖和木糖产乙醇的重组酿酒酵母。以本实验室专利菌株Saccharomyces cerevisiae Y5为宿主菌,将树干毕赤酵母Pichia stipitis CBS6054的木糖还原酶基因XYL1和木糖醇脱氢酶基因XYL2置于磷酸甘油酸激酶基因启动子(PGKp)控制下,酿酒酵母Y5内源的木酮糖激酶基因XKS1分别由己糖激酶基因启动子(HXK2p)及其内源启动子(XKS1p)控制。这3个基因连同各自表达元件导入宿主细胞中,打通其木糖上游代谢途径。酶活测定结果显示,HXK2p对木酮糖激酶表现出更强的启动效率。重组菌Y5-X3-1中木糖还原酶/木糖醇脱氢酶/木酮糖激酶(XR/XDH/XK)的酶活比值为1∶5∶4,其木糖消耗量是宿主菌的5倍,最高乙醇产量为24.35 g/L,达到理论值的73%。结果表明,通过调节XYL1、XYL2及XKS1启动子的强度,调控其表达水平,进而改变3种酶的活性水平,对于提高重组酿酒酵母利用木糖发酵产乙醇有明显效果。     

不同启动子控制下木酮糖激酶的差异表达及其对酿酒酵母木糖代谢的影响

[目的]以不同强度的启动子控制表达木酮糖激酶基因,并研究其引起的不同木酮糖激酶活性水平对木糖利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)代谢流向的影响.[方法]以酿酒酵母CEN.PK 113-5D为出发菌株,选择酿酒酵母内源启动子TEF1p,PGK1p和HXK2p,利用Cre-loxP无标记同源重组系统,置换染色体上木酮糖激酶基因XKS1的启动子(XKS1p)序列;并通过附加体质粒引入木糖代谢上游途径,构建不同水平表达木酮糖激酶的木糖利用工程菌株;从木酮糖激酶的转录水平、酶活水平、胞内的ATP浓度及木糖代谢等性状,对各菌株进行评价.[结果]转录及酶活测定结果显示,与天然状态相比,所选择的启动子对木酮糖激酶均表现出更强的启动效率.菌株体内表达木酮糖激酶活性水平由高至低的顺序为其基因XKS1在启动子PGK1p、TEF1p、HXK2p和XKS1p控制下.随着木酮糖激酶的活性的提高,胞内的ATP水平下降,而转化木糖生成乙醇的能力上升.最高乙醇产率为0.35g/g消耗的总糖,此时副产物木糖醇产率最低,为0.18g/g消耗的木糖.[结论]通过在染色体上置换启动子,提高了木酮糖激酶的表达水平.在一定范围内,木酮糖激酶的高活性有利于木糖向乙醇的转化.     

酿酒酵母工业菌株中XI木糖代谢途径的建立

根据代谢工程原理,采取多拷贝整合策略,利用整合载体pYMIKP,将来自嗜热细菌Thermusthermophilus的木糖异构酶(XI)基因xylA和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)自身的木酮糖激酶(XK)基因XKS1,插入酿酒酵母工业菌株NAN-27的染色体中,得到工程菌株NAN-114。酶活测定结果显示,NAN-114中XI和XK的活性均高于出发菌株NAN-27,表明外源蛋白在酿酒酵母工业菌株中得到活性表达。对木糖、葡萄糖共发酵摇瓶实验结果表明,工程菌NAN-114消耗木糖4.6g/L,产生乙醇6.9g/L,较出发菌株分别提高了43.8%和9.5%。首次在酿酒酵母工业菌株中建立了XI路径的木糖代谢途径。     

木酮糖激酶基因整合表达载体构建及在酿酒酵母中的过表达

【目的】以载体p406ADH1为构建骨架,构建一个酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工业菌株的整合表达载体。【方法】通过酶切连接的方式,将4个元件片段:作为筛选标记的G418抗性基因KanR,用于基因表达的ADH1终止子片段,酿酒酵母W5自身木酮糖激酶基因,18S rDNA介导的同源整合区,插入到骨架质粒p406ADH1中,得到多拷贝整合表达载体pCXS-RKTr。将该载体线性转化酿酒酵母后,对转化子中木酮糖激酶酶活进行测定,检测其表达情况。【结果】重组质粒在酿酒酵母体内实现了木酮糖激酶的高水平稳定表达,其酶活力是初始菌株的2.87倍。【结论】本实验构建了一个酿酒酵母工业菌株整合表达载体,并用此载体过表达了其自身的木酮糖激酶基因。该重组质粒载体的构建可以有效解决酿酒酵母中自身木酮糖激酶酶活较低的情况,这为利用木糖高产乙醇酿酒酵母基因工程菌株的构建和其它酵母重组质粒载体的构建奠定基础。     

白地霉的戊糖代谢——Ⅰ.木糖代谢的初步变化途径

(1)用在木糖上培养的白地霉2.361无細胞提取液进行了木糖代謝酶体系的研究。查明木糖代謝的初步变化途径如下: D-木糖 TPNH H~ →木糖还原酶←木糖醇 TPN~ (1) 木糖醇 DPN~ →木糖醇脫氫酶←D-木酮糖 DPNH H~ (2) D-木酮糖 ATP→D-木酮糖激酶D-木酮糖-5-磷酸(3) (2)催化式(1)的酶为木糖还原酶,需要TPN。用紙层析法鉴定木糖还原的产物为木糖醇。(3)催化式(2)的酶称木糖醇脫氫酶,需DPN。(4)催化式(3)的酶为D-木酮糖激酶,所試过的其他戊糖在同样条件下均不被磷酸化。(5)白地霉无細胞提取液中测不出木糖(?)构酶的活力。排除了这一途径的可能性。(6)催化式(1)(2)(3)各反应的酶均有适应形成的特性,符合Stanier的連續适应学說。     

友菌素核苷转移酶amiE基因的克隆、表达和功能鉴定

【目的】克隆和表达二糖核苷类抗生素友菌素生物合成基因簇中的核苷转移酶基因amiE,并研究AmiE的体外催化功能。【方法】采用PCR技术将编码257个氨基酸的葡萄糖-1-磷酸核苷转移酶基因amiE克隆到表达载体pET28a上,构建质粒pCSG4001,转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中诱导表达;利用亲和层析分离纯化蛋白AmiE,以葡萄糖-1-磷酸和胸腺嘧啶三磷酸(TTP)或尿嘧啶三磷酸(UTP)为底物,利用高效液相检测AmiE的体外酶活;以甘露糖-1-磷酸、半乳糖胺-1-磷酸和半乳糖-1-磷酸和TTP作为底物,进一步研究AmiE对底物的选择性。【结果】N-末端融合组氨酸标签的AmiE蛋白在大肠杆菌中获得了可溶性表达,通过亲和层析纯化出的AmiE能够以TTP(或UTP)和葡萄糖-1-磷酸作为底物,催化形成胸腺嘧啶二磷酸葡萄糖(TDP-glucose)或者尿嘧啶二磷酸葡萄糖(UDP-glucose),但对其他三种底物,无明显催化活性。【结论】大肠杆菌中表达纯化的核苷转移酶AmiE能够体外催化形成TDP-葡萄糖(或UDP-葡萄糖),确证了AmiE作为核苷转移酶的催化功能,同时表明AmiE对底物具有一定的选择性。     

在酿酒酵母中共表达XYLA和XKS1基因后利用木糖的初步研究

为了使酿酒酵母较好地利用木糖产生乙醇,将来自Thermus thermophilus的木糖异构酶基因XYLA和酿酒酵母自身的木酮糖激酶基因XKS1,构建到酵母表达载体pESC-LEU中,导入酿酒酵母YPH499中,同时成功表达了两种酶基因。该菌以木糖为唯一碳源进行限氧发酵,木糖的利用率为9.64%,为宿主菌的4.17倍,产生2.22 mmol.L-1的乙醇。同时初步探讨了两种酶基因的表达量对酿酒酵母发酵木糖生成乙醇的影响。木糖异构酶对木糖的利用起关键性的作用,木酮糖激酶的过量表达不利于乙醇生成。     

重组酿酒酵母腺苷激酶的表达、纯化和鉴定

腺苷激酶 (adenosinekinase ,AK)是控制细胞中腺苷浓度的一种关键酶 ,在许多细胞和组织中发挥着重要的生理效应子作用。从酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)中克隆了腺苷激酶基因 (ak) ,并将其接入大肠杆菌pET16b表达质粒中进行表达。重组蛋白质经部分纯化后 ,测定其酶动力学常数 ,结果表明该酶对腺苷的Km 值为 (3.5± 0 .2 ) μmol L ,对ATP的Km 值为(10 0 .0± 11.0 ) μmol L ,对腺苷的kcat值为 (15 30± 2 0 )min- 1 ,对ATP的kcat值为 (14 4 8± 2 5 )min- 1 。该酶对其他核苷和脱氧核苷的Km 值测定数据表明 ,从酵母中克隆得到的该重组腺苷激酶具有较高的底物特异性。     

白地霉的戊糖代谢 Ⅱ.L-阿拉伯糖代谢途径

用在L-阿拉伯糖上培养的白地霉(Geotrichum candidum Link)2.361无细胞提取液进行了L-阿拉伯糖代谢酶体系的研究。查明L-阿拉伯糖代谢的变化途径如下: L-阿拉伯糖+NADPH_2 戊醛糖还原酶L-阿拉伯糖醇+NADP L-阿拉伯糖醇+NAD L-阿拉伯糖醇脱氢酶L-木酮糖+NADH_2 L-木酮糖+NADPH_2 NADP-木糖醇脱氢酶木糖醇+NADP 木糖醇+NAD NAD-木糖醇脱氢酶D-木酮糖+NADH_2 D-木酮糖+ATP D-木酮糖激酶→D-木酮糖-5-磷酸+ADP L-阿拉伯糖醇脱氢酶仅存在于L-阿拉伯糖培养的菌体中,而不存在于木糖培养的菌体中。可见它与木糖醇脱氢酶不是同一个酶。这一点与文献报导的不同,在黄青霉中这两种酶活力被认为是同一种酶的作用。