p27kip1蛋白在胶质瘤细胞中的表达及定位研究

目的：探讨胶质瘤细胞中p27酬蛋白的表达、定位,为进一步研究p27kip1在胶质瘤发生、发展过程中的功能奠定理论基础。方法：用免疫荧光方法检测U87、LN308细胞p27kiP1蛋白的定位情况;进一步分离两种细胞的细胞质与细胞核,在显微镜下观察细胞核形态并用DAPI染色分析细胞核完整性,提取蛋白用Westernblotting。方法检测分离的细胞质与细胞核蛋白的纯度,并检测p27kip1,在细胞中的表达情况。结果：成功分离了细胞的细胞浆与细胞核,并得到纯度较好的细胞浆蛋白与细胞核蛋白。确定了p27kip1蛋白主要表达于U87和LN308细胞的细胞质中。结论：p27kip1蛋白在恶性胶质瘤中可能主要表达在细胞质中,并且其亚细胞定位可能与胶质瘤的恶性程度相关。     

CMV与SP双启动子增强外源基因在小鼠骨骼肌中的表达效率

构建分别含有CMV、肌肉特异启动子SP及双启动子CMV-SP的真核报告基因EGFP表达载体（pCMV-EGFP、pSP-EGFP及pCMV-SP-EGFP）和生长激素释放因子（GRF）表达载体（pCMV-GRF、pSP-GRF和pCMV-SP-GRF）.将3种EGFP表达质粒分别注射至小鼠骨骼肌.注射后1周、2周、3周以及4周时,分别提取肌肉组织RNA,应用半定量RT-PCR检测报告基因（EGFP）的表达量,发现pCMV-SP-EGFP组EGFP表达量显著高于pCMV-EGFP组和pSP-EGFP组（P<0.01）;经荧光检测得到了较强的荧光信号.将3种GRF表达质粒分别注射至小鼠骨骼肌,在注射后每10 d记录小鼠累积增重,采血并用RIA法测定血清胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）浓度,结果pCMVSP-GRF组累积增重、IGF-I浓度分别高于生理盐水组、pCMV-GRF组和pSP-GRF组（P<0.05）.结果表明：CMV与SP两种启动子组合,在小鼠骨骼肌内使外源基因表达效率提高.本研究为提高外源基因在肌肉组织的表达提供了新的途径.     

乳腺上皮细胞特异性敲除Scrib基因杂合子小鼠的制作与鉴定

目的利用Cre．LoxP重组酶系统构建乳腺上皮细胞特异性敲除Serib基因杂合子小鼠,并进行鉴定,为进一步在动物整体水平研究Scrib基因在乳腺癌中的作用提供研究平台。方法将Scrib条件敲除杂合子小鼠（Scrib＋/ft小鼠）进行繁殖并鉴定,然后将鉴定结果为阳性的子代Scrib＋/ft小鼠与乳腺上皮细胞特异性表达Cre重组酶的MMTV．Cre纯合子小鼠进行杂交,鉴定其子代小鼠的基因型。结果成功繁育Scrib条件敲除小鼠和MMTV．Cre小鼠,并通过鉴定得到Scrib＋/ft小鼠,与MMTV-Cre小鼠杂交并繁殖,获得基因型为Scrib＋/ft;MMTVCre＋/-小鼠5只。结论本研究利用Cre．LoxP重组酶系统成功构建了乳腺上皮细胞特异性敲除Scrib基因杂合子小鼠,为进一步研究极性蛋白Scrib表达下调在乳腺癌发生中的作用提供了良好的动物模型。     

慢病毒载体介导GHRH基因在小鼠肌肉组织表达及对动物生长的影响

人与动物体内生长激素受生长激素释放激素(Growth Hormone Releasing Hormone,GHRH)与生长激素抑制激素(Somatostatin,SST)两种因子共同调节,在体内表达外源GHRH,可以提高体内GH基础水平,进而达到促进体内GH释放,加速动物生长的效果.对慢病毒载体系统加以改造,使之成为C...     

石蜡组织荧光原位杂交关键实验步骤探讨

目的：探讨石蜡组织荧光原位杂交（FISH）技术中关键实验步骤的最佳条件,以期提高石蜡切片FISH阳性细胞检出率和实验成功率。方法：在前期标本处理方面,进行双蒸水、0．5×SSC溶液、0．1％硫代亚硫酸钠溶液煮沸对比;在蛋白酶消化方面,设置胃蛋白酶和蛋白酶K两种消化方法,并在37℃条件下设置时间的梯度变化,比较其消化效果;对石蜡切片的变性设置温度梯度,比较杂交检出率;比较DAPI复染时不同浓度对单色、双色FISH结果的影响;应用抗淬灭剂后不同保存时间的对比。结果：采用0．5×SSC溶液煮沸15min,用200μg／mL蛋白酶K在37℃、6～10min条件下消化,可以取得较好的FISH效果;变性温度为81℃时检出率更高,DAPI复染浓度为1000ng／mL时针对单色FISH较合适,而浓度为500、150ng／mL时针对双色／多色FISH有较好的效果。结论：FISH条件经过对比得到优化,对石蜡组织FISH实验具有一定的指导意义。