海南黄牛HSF1 cDNA全长的克隆与序列分析

目的：根据人、小鼠HSF1cDNA保守区序列设计引物,通过PCR方法扩增海南黄牛HSF1cDNA,并进行序列分析。方法：利用RT-PCR、半巢式PCR以及3＇-RACE技术分段扩增得到了海南黄牛HSF1cDNA序列,测序正确后进行拼接。用DNAMAN 生物信息学软件分析海南黄牛HSF1 cDNA与赫里福德牛、人、小鼠同源性和海南黄牛HSF1蛋白的氨基酸组成、等电点、亲/疏水区等蛋白质性质,并根据各种动物HSF1蛋白绘制进化树。结果：（1）海南黄牛的HSF1 cDNA序列全长为1 993bp,包括150bp的5＇非翻译区,1 578bp的开放阅读框以及264bp（不含poly（A）尾）的3＇非翻译区,编码524个氨基酸,分子量为56.42 kD,等电点（pI）为 4.79。（2）海南黄牛的HSF1 cDNA与赫里福德牛、小鼠和人HSF1 cDNA的同源性分别为98.99 %、81.78 %、87.82 %,相应编码蛋白氨基酸序列的同源性分别为98.86 %、83.84 %、89.06 %,其中N-末端和C-末端高度保守,而中间区域存在缺失或替换。（3）根据氨基酸序列构建不同动物HSF1蛋白的进化树,与采用经典遗传分类法构建的进化树基本一致。结论：首次克隆了海南黄牛 HSF1 cDNA全长,分析表明：海南黄牛HSF1蛋白是亲水性蛋白,在8种动物中,其同源性大于73 %,高度保守。海南黄牛与赫里福德牛HSF1蛋白同源性高达98.86 %,在三聚体化区域、转录调节域和激活域存在6个位点的单氨基酸突变,这些发现为进一步揭示海南黄牛抗热性状形成的分子机制提供了重要依据。     

黑眶蟾蜍皮肤抗菌肽的制备及其性质

收集黑眶蟾蜍皮肤分泌物,经Sephadex G-25去除大分子蛋白后,利用微量测定法进行抗菌活性分析。结果发现:黑眶蟾蜍皮肤分泌物对革兰氏阳性菌——金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑制作用较强,对革兰氏阴性菌中的嗜水气单细胞菌也表现出较强的抑制作用,对溶藻弧菌、副溶血弧菌、河流弧菌、大肠杆菌的抑制相对较弱。利用胰蛋白酶对黑眶蟾蜍皮肤抗菌肽水解后,其抗菌活性消失。将黑眶蟾蜍皮肤抗菌肽在37~95℃和pH 2.5~5.0下保温,发现其抗菌活性成分对热及酸耐受性较强。黑眶蟾蜍皮肤分泌物在低浓度无溶血活性。     

鲑点石斑鱼皮肤抗菌活性蛋白的纯化及抗菌活性(英文）

近年来在多种生物体中都发现有抗菌活性蛋白和多肽。由于其具有生物化学多样性,抗病毒、微生物、真菌、原生动物、肿瘤,促进伤口愈合等生物学活性,而引起研究者的极大兴趣。抗菌活性蛋白和多肽在动物的先天免疫中具有重要作用,它们直接作用于细菌,并将其杀死。鲑点石斑鱼(Epinephelusfario)是中国南方水产养殖中重要的海水鱼。近年来,由于细菌和病毒引发的病害造成鲑点石斑鱼大量死亡,但其抗菌活性蛋白及多肽目前还未见报道。本研究发现鲑点石斑鱼皮肤具有抗菌活性成分,鲑点石斑鱼皮肤匀浆物经胰蛋白酶水解后抗菌活性丧失,说明该活性是由蛋白质引起的。经离子交换层析及凝胶过滤层析,从鲑点石斑鱼皮肤中分离纯化到抗菌活性蛋白(Efap)。SDS-PAGE显示,Efap为单链蛋白,分子量约41kD。该成分能同时抑制革兰氏阳性菌,如金黄色葡萄球菌、滕黄微球菌、枯草牙胞杆菌和革兰氏阴性菌,如溶藻弧菌、副溶血弧菌、河流弧菌、多杀性巴氏杆菌、嗜水气单胞菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌。革兰氏阴性菌中,溶藻弧菌、副溶血弧菌、河流弧菌和多杀性巴氏杆菌对Efap较敏感,MIC<20mol/L,其他3种菌敏感性较差,MIC>20mol/L。另外,Efap显示出较强的抗金黄色葡萄球菌的活性,MIC为5—10mol/L。Efap的广谱抗菌性,说明其在鲑点石斑鱼免疫防御中具有一定的作用。     

一株羊源A型多杀性巴氏杆菌的全基因组测序及生物学特性分析

[背景] 多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）是一种革兰氏阴性菌,可引起动物和人类的呼吸道疾病和败血症等。本实验室前期分离鉴定一株A型Pm HN02菌株。[目的] 通过对HN02菌株的全基因组测序及生物信息学分析,扩充多杀性巴氏杆菌的基因组数据库信息;通过毒力基因鉴定和系统进化树分析,明确该菌株含有的毒力基因和遗传进化关系,为临床预防和诊断提供理论依据。[方法] 使用单分子实时测序（Single Molecule Real Time Sequencing,SMRT）技术对Pm HN02菌株进行全基因组测序,利用Illumina测序校正后进行基因功能注释和生物信息学分析。使用PCR鉴定菌株毒力基因,并构建进化树进行分析。[结果] Pm HN02菌株全基因组大小为2 333 292 bp,GC含量为40.15mol%,预测到的编码基因有2 389个,包含19个rRNA （6个23S rRNA、6个16S rRNA、7个5S rRNA）、62个tRNA基因、5个sRNA;含84个串联重复序列、66个小卫星DNA、2个微卫星DNA、9个基因岛、9个前噬菌体;分别有1 648、2 190和1 917个基因注释在GO、KEGG和COG数据库中,而且大部分富集于Pm的代谢过程;还有85个III型分泌系统效应蛋白、191个表型突变基因、165个毒力因子相关基因。根据分析结果绘制该菌株的全基因组圈图,并将基因组信息提交至NCBI后获得登录号cp037865。PCR鉴定发现该菌株含有fimA、toxA等14个毒力基因,缺失了tadD等毒力基因。系统进化树分析发现该菌株同北京的Pm3菌株（MH150895.1）进化关系最接近。[结论] 研究完成了A型Pm HN02株的全基因组测序和生物学特性鉴定,揭示了其同国内外Pm分离株的进化关系,为预防Pm疾病流行和探索Pm致病机制提供了参考。