无血清无饲养层培养体系在绵羊胚胎干细胞分离中的应用

目的:本文采用N2B27无血清无饲养层的完全已知成份的培养体系,通过机械分离法分离不同阶段的绵羊囊胚,观察不同阶段囊胚对分离绵羊类胚胎干细胞的影响。方法:本实验采用N2B27无血清无饲养层成份完全已知的培养体系,利用机械分离法对不同阶段的绵羊囊胚进行分离,观察其绵羊类胚胎干细胞的原代集落形成率,以及AKP染色,多潜能性候选基因Oct-4和Sox-2免疫荧光检测。结果:分离早期阶段绵羊囊胚获得的绵羊类胚胎干细胞的形成率显著低于扩张(孵化)阶段囊胚(19.6%(11/56)vs 36.9%(31/84))(P0.05),同时早期和扩张(孵化)阶段绵羊囊胚的AKP染色和多潜能性候选基因Oct-4、Sox-2的表达呈阳性。结论:N2B27无血清无饲养层培养体系是一种有效分离绵羊类胚胎干细胞的培养基,同时分离绵羊扩张(孵化)阶段的囊胚可以显著的提高原代类胚胎干细胞的建系率,为提高绵羊类胚胎干细胞的建系奠定了基础。     

牛卵母细胞玻璃化冷冻对基因mRNA表达量的影响

目的 将处于生发泡期(GV期)和体外成熟期(IVM)的牛卵母细胞进行玻璃化冷冻.解冻,对其卵裂率和囊胚率以及一些与发育相关基因的mRNA表达量进行评价.方法 玻璃化冷冻GV期(n=224)和IVM期(n=235)牛卵母细胞,解冻后对其进行体外培养并采用quantitative real time-PCR技术对冷冻.解冻...     

3种药物对老化卵母细胞4种母源mRNA水平的影响

利用Real-Time PCR技术定量分析了绵羊(Ovis aries)卵母细胞在生长-成熟-老化过程4种母源mRNA(Mater、Zar1、Dnmt1、GDF9)发生的动态变化,以及3种药物(咖啡因、DTT和矾酸盐)对老化卵母细胞母源mRNA水平的影响。结果显示,除Dnmt1在12 h开始下降外,卵母细胞中其他3个基因的表达量都是从生发泡期逐渐下降,且在体外培养至24 h降到最低,然后随着卵母细胞的老化又逐渐上升。其中GDF9和Mater 2个基因在30 h组的卵母细胞中的表达量显著高于24 h组卵母细胞(P0.05)。30 h卵母细胞中Zar1和Dnmt1的转录水平与24 h卵母细胞差异不显著(P0.05)。除Zar1外,咖啡因和DTT都显著降低了老化卵母细胞中其他3个基因的表达量(P0.05),且所有基因表达量与24 h组卵母细胞差异不显著(P0.05)。矾酸盐处理后的卵母细胞其4种母源mRNA水平都是最高,除Zar1外其他3个基因表达量都显著高于24 h组(P0.05)。结论是,Mater、Zar1、Dnmt1、GDF9 4种母源mRNA水平与卵母细胞质量成反比,咖啡因和DTT能在一定程度上延缓卵母细胞的衰老,改善卵母细胞质量;而矾酸盐则加速了卵母细胞老化进程,降低了卵母细胞质量。     

绵羊类胚胎干细胞长期培养中增殖、凋亡、多能性相关基因的表达动力学

已报道的家畜类胚胎干细胞(embryonic stem-like cell, ESC-like)均无法实现长期培养,这制约了家畜ESC的研究．通过检测本实验室建系的绵羊类胚胎干细胞oESC-like,探究导致oESC-like无法持续培养的原因,为以后的研究打下基础. 实验观察了oESC-like形态变化,检测了AKP的表达,使用免疫荧光技术检测了PCNA、Bcl-2、Bax、Sox-2、Oct-4蛋白的表达,并用软件Image-Pro Plus 60计算蛋白表达水平．结果显示,oESC-like在长期培养过程中其形态具备ESC的典型形态特征;AKP持续表达;Sox-2和Oct-4的表达有不同程度的提高,增殖能力无明显变化;Bax表达水平逐代提高,Bcl-2的表达水平在5、10代显著高于Bax的表达水平可抑制Bax的活化,而从15代开始Bcl-2表达水平下降,低于Bax的表达水平,不能有效地抑制Bax的活化;Bcl-2/Bax表达水平的比值逐代下降,说明oESC-like在长期培养过程中逐渐走向凋亡.为解决绵羊类胚胎干细胞能够体外长期培养的科学问题,针对本实验室已有研究成果和存在的问题,进行逆向思维找出突破口,为遗传育种、基因工程、医疗等方面在实践上提供理论基础.     

bFGF浓度对oESC-like增值、凋亡、多能性相关基因表达的影响

使用免疫荧光技术检测与增值、凋亡、多能性相关基因的表达水平。提高bFGF浓度可增强PCNA、Oct-4、Sox-2、Bax和Bcl-2的表达,同时使Bcl-2/Bax比值维持较稳定水平。结果表明提高bFGF浓度可增强oESC-like的增值能力和多能性,增强其抗凋亡能力以适应长期培养。     

无血清无饲养层培养体系在绵羊胚胎干细胞分离中的应用

目的：本文采用N2B27无血清无饲养层的完全已知成份的培养体系,通过机械分离法分离不同阶段的绵羊囊胚,观察不同阶段囊胚对分离绵羊类胚胎干细胞的影响。方法：本实验采用N2B27无血清无饲养层成份完全已知的培养体系,利用机械分离法对不同阶段的绵羊囊胚进行分离,观察其绵羊类胚胎干细胞的原代集落形成率,以及AKP 染色,多潜能性候选基因Oct-4 和Sox-2 免疫荧光检测。结果：分离早期阶段绵羊囊胚获得的绵羊类胚胎干细胞的形成率显著低于扩张（孵化）阶段囊胚（19.6%（11/56） vs 36.9%（31/84））（P ＜ 0.05）,同时早期和扩张（孵化）阶段绵羊囊胚的AKP 染色和多潜能性候选基因Oct-4、Sox-2 的表达呈阳性。结论：N2B27无血清无饲养层培养体系是一种有效分离绵羊类胚胎干细胞的培养基,同时分离绵羊扩张（孵化）阶段的囊胚可以显著的提高原代类胚胎干细胞的建系率,为提高绵羊类胚胎干细胞的建系奠定了基础。