丝状真菌里氏木霉中shRNA沉默红色荧光基因

报道了在里氏木霉中建立的一种以红色荧光蛋白(DsRed)为报告基因的RNA干扰方法。首先,将构建的表达DsRed质粒p ANRed1转化里氏木霉QM9414,得到抗潮霉素B抗性并能稳定表达DsRed的菌株DsRed-T.reesei。其次,以丙酮酸脱氢酶启动子Ppdc和纤维二糖水解酶I终止子cbh I为原件,克隆到载体p PHL上构建质粒p PHL-Ppdc-Tcbh1。根据DsRed基因序列设计特定的siRNA干扰序列和另一条无同源序列的siRNA作为阴性对照,克隆到载体p PHL-Ppdc-Tcbh1得到重组质粒。将其转化到DsRed-T.reesei中,用含有100μg/m L潮霉素B和250μg/m L腐草霉素的PDA平板筛选转化子。结果表明,约79%的转化子出现红色荧光沉默现象,其中一些转化子DsRed的表达几乎完全被抑制。荧光定量PCR和Western印迹分析显示DsRed基因的表达受到不同程度的下调。以上结果提示,在里氏木霉中可用此方法研究基因表达调控。