假单胞杆菌D-海因酶的纯化及酶学性质

D 海因酶是工业上生产D 型氨基酸的关键酶 ,用热变性 ,硫酸铵沉淀及SepharoseQfastflow ,Phenyl Sepharosefastflow ,Superose 1 2等柱层析步骤从Pseudomonas 2 2 62菌体中分离纯化了该酶 ,纯化倍数约为 60 ,活力回收约为 1 6%。该酶为同源二聚体 ,分子量约为 1 0 9kD ,亚基分子量约为 53 7kD ,反应最适pH为 8 0 ,最适温度为 70℃ ,在pH6.0～ 1 0 0和温度 60℃以下稳定 ,该酶对巯基试剂敏感 ,大多数二价金属离子如镁、锰离子等能促使酶活提高 ,但高浓度锌离子能抑制酶活 ,以二氢尿嘧啶为底物的米氏常数Km =2 .5× 1 0 - 2 mol L。该酶的N末端1 0个氨基酸残基依次为MDKLIKNGTI     

重组谷糠源过氧化物酶的克隆、表达及逆转结肠癌化疗耐药活性

本课题组前期首次从谷糠中获得具抗肿瘤活性的过氧化物酶FMBP。为了该蛋白质后期在体外的规模化生产,本研究以谷子cDNA为模板,利用基因工程手段构建了pMal-s-FMBP融合质粒,并优化诱导条件进行原核表达与纯化,最终获得纯度大于90 %的具抗肿瘤活性的重组FMBP（Re-FMBP）。研究发现,Re-FMBP可以逆转HCT-8/5-Fu耐药细胞对5-Fu的耐药性,耐药逆转倍数达到9.6倍。通过Annexin V/碘化丙啶双染色流式细胞仪检测显示：Re-FMBP能够诱导HCT-8/5-Fu耐药细胞发生凋亡;通过罗丹明123染色,流式细胞仪检测结果显示,Re-FMBP处理后,HCT-8/5-Fu耐药细胞内的荧光强度增强。说明Re-FMBP能够增加5-Fu药物在HCT-8/5-Fu耐药细胞内的蓄积。结果揭示,Re-FMBP蛋白可通过抑制耐药细胞增殖,诱导耐药细胞凋亡,抑制耐药细胞对5-Fu药物外排功能来增加HCT-8/5-Fu耐药细胞对5-Fu药物的敏感性。因此,谷糠来源的Re-FMBP蛋白可以作为肿瘤化疗辅助药物来开发。     

假单胞杆菌D-海因酶的纯化及酶学性质

D-海因酶是工业上生产D-型氨基酸的关键酶,用热变性,硫酸铵沉淀及Sepharose Q fast flow,Phenyl-Sepharose fast flow,Superose 12等柱层析步骤从pseudomonas2262菌体中分离纯化了该酶,纯化倍数约为60,活力回收约为16%.该酶为同源二聚体,分子量约为109kD,亚基分子量约为53.7kD,反应最适pH为8.0,最适温度为70℃,在pH6.0～10.0和温度60℃以下稳定,该酶对巯基试剂敏感,大多数二价金属离子如镁、锰离子等能促使酶活提高,但高浓度锌离子能抑制酶活,以二氢尿嘧啶为底物的米氏常数Km=2.5×10-2mol/L.该酶的N末端10个氨基酸残基依次为MDKLIKNGTI.     

阿魏酸结合吡咯啉-5-羧酸还原酶1抑制乳腺癌细胞增殖

乳腺癌是女性常见恶性肿瘤之一，严重威胁女性健康。天然产物因其结构多样、毒副作用低及作用机制独特等优势已然成为开发抗肿瘤药物的主要来源。以人乳腺癌细胞MCF-7和小鼠乳腺癌细胞4T1为研究对象，探索植物源多酚类物质阿魏酸(ferulic acid, FA)对乳腺癌细胞的影响。细胞存活实验和克隆形成实验表明，阿魏酸可以抑制MCF-7和4T1细胞的存活和增殖，且抑制效应具有浓度依赖性。通过Pull-down、银染和LC-MS-MS质谱鉴定分析发现，FA与蛋白质吡咯啉-5-羧酸还原酶1(pyrroline-5-carboxylate reductase 1,PYCR1)有直接相互作用。PYCR1体内能通过酶促反应催化脯氨酸代谢合成，发挥促进肿瘤生长和增殖的作用。使用Autodock Vina和PyMOL软件模拟分子对接，结果显示，FA与PYCR1的246位谷氨酸和251位精氨酸存在相互作用；通过酶活力检测证实，FA靶向结合PYCR1且以浓度依赖性的方式抑制其酶活性；通过分析人类肿瘤基因图谱(TCGA)发现，PYCR1在乳腺癌患者中的表达显著高于健康对照人群(P<0.0001),且高表达的...