利用ATP扩增反应与生物发光法结合检测微量微生物

摘要:【目的】腺苷酸激酶（adenylate kinase, ADK）和多聚磷酸盐激酶（polyphosphate kinase, PPK）偶联催化的ATP扩增反应结合生物发光检测法能够对微量微生物进行检测。但是PPK当中结合的内源性的ADP会产生背景干扰,影响测定。本文旨在融合表达ADK和PPK,并建立一种方便有效的内源性ADP的去除方法,降低背景,使之与传统生物发光法结合,实现高灵敏生物发光法检测微量ATP及微生物。【方法】PCR扩增得到PPK、ADK基因,插入表达载体pET28a (+)中构建重组表达质粒pET28a (+)-PPKADK,表达PPK-ADK融合蛋白。利用表面包裹聚胺醇（Polyurethane）的磁珠（magnetic beads）,通过化学反应将腺苷酸双磷酸酶（apyrase）固定于磁珠表面,制备固相腺苷酸双磷酸酶（Beads-apyrase）,用于除去与融合蛋白结合的内源性ADP,降低ATP扩增反应的背景,从而使之与生物发光反应相结合,测定微量外源ATP及细菌菌落数。【结果】表达的融合蛋白具有PPK和ADK的活性,利用Beads-apyrase可以方便而有效的去除内源性ADP,显著地降低反应背景,从而实现了利用ATP扩增反应与传统生物发光反应结合,测定了小于1 fmol的外源微量ATP,使生物发光法检测ATP及微生物的灵敏度提高至少100倍。【结论】利用Beads-apyrase能够方便、有效地降低PPK-ADK中的ADP背景,从而使PPK-ADK催化的ATP扩增反应能够与传统生物发光法相结合,极大地提高了生物发光法的灵敏度。     

三酶焦测序体系的建立及其在唐氏综合征快速诊断中的应用

为了避免四酶焦测序体系中由于三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)造成的测序结果偏差, 文章建立了一种定量性能好的无三磷酸腺苷双磷酸酶的三酶焦测序体系。方法是将生物素修饰的DNA模板、荧光素酶和ATP硫酸化酶固定在磁性微球表面进行焦测序反应, 当加入一种dNTP进行焦测序反应完后, 采用磁性分离技术, 除去焦测序反应产生的ATP和剩余的dNTP, 然后加入另一种dNTP进行测序, 按同样的方法去除影响下一轮测序反应的成分, 实现循环测序。此体系能准确判读待测DNA的碱基序列, 且可定量测定单核苷酸序列多态性(SNP)中两种等位基因型的相对比值。文章成功检测了16例正常人和8例唐氏综合征患者样本中21号染色体上两个杂合率较高位点(rs1042917和 rs4818219)的等位基因型比值, 所得结果能够明确说明待测样本中来自于父方和母方的21号染色体数目是否相等。该法具有良好的定量性能, 适合于SNP等位基因型的定量分析, 可以用于唐氏综合征的快速检测。