K亚群禽白血病病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank数据库K亚群禽白血病病毒(Subgroup K avian leukosis virus,ALV-K)特异性抗原gp85的基因序列,设计一组ALV-K特异性的引物和探针,并构建阳性重组质粒。在对反应体系进行优化的基础上,建立了ALV-K的实时荧光RT-PCR检测方法并进行了特异性试验、敏感性试验和重复性试验。结果显示,本方法能对ALV-K进行特异性扩增,而对A亚群、B亚群、J亚群、E亚群禽白血病毒和新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、禽网状内皮组织增生病病毒(REV)、禽流感病毒(AIV)等禽病病原未见扩增。该方法最低能够检测到3.4×10~1拷贝数/μL的阳性质粒,灵敏度是RT-PCR的100倍。应用本方法对人工攻毒ALV-K的SPF鸡各脏器进行病毒定量分析,结果显示,在攻毒鸡体内心、肝、脾、肺、肾等脏器中均能检测到ALV-K,且肝、肾和脾中的病毒含量显著高于心和肺(P0.01)。     

YXXM 基序对J 亚群禽白血病病毒复制的影响

[目的]毒株NX0101是骨髓瘤病变型J亚群禽白血病病毒,其早期感染细胞能诱导PI3 K/Akt信号转导通路的激活,本文针对NX0101毒株是否存在YXXM基序及其作用进行了探讨.[方法]利用TMpred软件对NX0101毒株囊膜蛋白(Env)的氨基酸序列进行生物信息学分析,通过搭桥PCR方法将YXXM基序相应的核苷酸序列突变后,构建突变质粒并转染DF-1细胞,拯救出YXXM突变体毒株NX0101 mt( Y/F,M/A),利用real-time PCR和ELISA方法检测并比较YXXM突变前后毒株在RNA水平和蛋白水平的复制情况.[结果]NX0101毒株Env胞浆区554 -557位氨基酸存在典型的PI3K结合基序YXXM.YXXM基序突变后,病毒RNA转录水平和病毒蛋白合成水平都显著下降.[结论]YXXM基序对NX0101毒株在体外宿主细胞中复制发挥重要的作用.     

458例包皮龟头炎真菌感染检测及药敏试验

目的了解本地区包皮龟头炎患者中真菌感染情况及对抗生素的敏感性。方法分别采用显微镜、科玛嘉念珠菌显色培养基、法国梅里埃公司的ATB ID32C酵母菌鉴定卡和Rosco纸片扩散法对包皮龟头分泌物进行直接镜检、念珠菌培养、菌种鉴定及药敏试验。结果 458例患者中153例直接镜检阳性,培养分离出念珠菌共157株,念珠菌培养阳性率为33.4%(153/458),其中白念珠菌116株,占73.9%(116/157),非白念珠菌41株,占26.1%(41/157);120例对照组中有17例培养出念珠菌,阳性率为14.2%(17/120),其中白念珠菌6株,占35.3%(6/17),非白念珠菌11株,占64.7%(11/17)。包皮龟头炎患者组念珠菌的培养阳性率和白念珠菌的比例均高于健康对照组,差异有统计学意义(χ2=16.95,χ2=10.72,P均0.05)。157株致病菌株对制霉菌素和酮康唑的敏感率均90%,分别为97.5%和93.0%,对氟康唑敏感率为79.6%,而对特比萘芬敏感性最低,为33.8%。结论念珠菌感染是本地区包皮龟头炎发病的重要因素,感染的致病菌种以白念珠菌为主,分离的致病性念珠菌对多烯类药物敏感率较高,对唑类抗真菌药有不同程度的交叉耐药,不同菌型其药敏谱存在差异。     

不同病变型J亚群禽白血病病毒LTR启动子序列分析及活性比较

从ALV-J中国地方分离株SCAU-HN06株(血管瘤病变型)、NX0101株和JS-nt株(骨髓瘤病变型)病毒的细胞培养物提取前病毒DNA,通过PCR扩增各毒株的LTR并克隆,随后进行测序分析。与国内外ALV-J参考毒株LTR序列比较发现:国内地方分离株与英国ALV-J原型株HPRS-103和美国ALV-J原型株ADOL-7501的LTR核苷酸序列相似性为88.0%~97.2%;LTR中的U5区及R区具有较高的保守性,而U3区内存在较大差异。将不同病变型ALV-J的LTR片段分别插入pCAT-basic载体CAT报告基因5'端。用所得的重组报告基因表达质粒转染DF-1细胞,48h后通过测定转染细胞中的CAT表达量来评价LTR启动子的活性。结果表明,SCAU-HN06株与骨髓瘤病变型ALV-J(JS-nt株,NX0101株)LTR启动子活性差异不显著。