基于高通量测序的稀释平板计数细菌群落变化研究

【目的】明确平板计数法中不同稀释梯度对土壤细菌数量和组成的影响规律,比较稀释平板计数法和高通量测序研究土地利用方式变化下土壤细菌群落的差异。【方法】针对不同土地利用方式下的4种土壤(次生林、健康蕉园、发病蕉园和水稻土),设置5个土壤悬液10^-1-10^-5稀释梯度开展平板计数,获得平板上可培养细菌富集物并提取总DNA;同时直接提取原位土壤微生物总DNA,高通量测序细菌富集物DNA和土壤总DNA中的16S rRNA基因,研究不同土壤悬液稀释梯度下的可培养细菌群落和背景土壤细菌多样性,明确可培养细菌占土壤总细菌的比例以及多样性差异。【结果】次生林垦殖为蕉园土壤后土壤呼吸增幅最高,细菌数量降幅最高,稀释平板计数与实时荧光定量PCR (real-time fluorescent quantitative PCR)结果一致,但其他土地利用方式变化的稀释平板计数与实时荧光定量细菌数量的结果并不完全一致。连续稀释显著降低了可培养细菌多样性。与原位土壤总细菌相比,土壤可培养细菌群落Chao 1指数降幅高达86%-98%。与土壤悬液稀释10倍(10^-1)相比,稀释100-10万倍(10^-2-10^-5)后可培养细菌群落Chao 1指数降幅高达35%-60%。连续梯度稀释也降低了物种多样性,所有稀释梯度共检测到315-401个微生物属,共有属仅为21-38个,而10^-1梯度独有属有92-210个,10^-2-10^-5梯度独有属为2-59个。4种土壤中可培养细菌占背景土壤总细菌比例范围为：16.1%-47.7% (门水平),7.4%-30.9% (属水平)。两两比较不同土地利用方式间的显著差异物种,可培养方法获得的显著增加和减少的物种数量仅为高通量直接测序原位土壤结果的9.7%和22.9%;免培养和可培养均发现了一些共同的差异物种,包括Bacillaceae、Micrococcaceae、Microbacterium、Comamonadaceae和Burkholderiales。【结论】传统稀释平板计数可培养细菌数量过程中,10^-1稀释梯度下可培养细菌比例及多样性明显高于10^-2-10^-5梯度,而10^-2-10^-5梯度之间并无明显差异。表明传统稀释平板计数过程中,遗漏了相当数量的独特微生物属,其比例范围为35.9%-99.0%。可培养法和免培养法均发现,土地利用方式变化可导致一些微生物类群显著降低,如Microbacterium。尽管可培养方法低估了不同土地利用方式间细菌群落的差异,但可培养与免培养方法发现了共同的差异细菌类群。与4种土壤中细菌本底丰度相比,固体平板显著富集Pseudomonas和Flavobacterium,增加倍数分别为2 233-5 805倍和43-4 506倍。未来应耦合分子生态学与可培养技术深入发掘复杂土壤环境中的微生物资源。     

矿区复合污染土壤真菌多样性及其对稀土-重金属离子的吸附特征

大量的稀土-重金属通过尾矿坝的浮尘、地表径流和渗滤液排放到周边土壤中,影响了土壤中的微生物群落结构。【目的】分析稀土和重金属复合污染土壤真菌群落结构并分离具有同时吸附稀土和重金属的菌株。【方法】本研究基于ITS基因,采用Illumina-Hiseq测序技术分析了包头稀土尾矿坝周边5份稀土-重金属污染土壤样品和距尾矿区20 km的1份相对未受污染的土壤样品的真菌群落特征,同时采用富集培养法从污染样品中筛选出金属耐性真菌,并对其进行吸附稀土-重金属的特性分析。【结果】群落结构为:在门水平,除了未分类门真菌(unclassified Fungi)外,子囊菌门(Ascomycota)真菌在所有土壤中占比较大(13.5%–90.5%);在纲水平上,除了未分类纲真菌外,粪壳菌纲(Sordariomycetes)真菌在B2 (73.1%)、B3 (28.4%)和B4 (20.8%)的丰度显著高于对照样点C (7.4%),而座囊菌纲(Dothideomycetes)在B5 (11.8%)的丰度明显高于B1 (3.5%);在属水平,除了未分类属,足孢子虫属(Podospora)是C(0.9%)和B3(23.6%)样点的优势种。曲霉属(Aspergillus)、未分类的格孢腔菌目(unclassified Pleosporales)和未分类的戴维迪科(unclassified Davidiellaceae)分别为B1 (3.0%)、B4 (10.5%)和B5(5.8%)的优势种,而蜡蚧属(Lecanicillium)真菌只在B2样点土壤存在且占优(51.6%)。Zn污染对真菌群落结构的影响大于稀土元素污染,且其浓度与优势的未分类真菌相对丰度呈负相关。从污染样品中共分离出6株真菌,它们分属于曲霉属(Aspergillus)(5株)和镰刀霉菌属(Fusarium)(1株)。所有分离菌株对镧(La~(3+))的吸附率均显著高于锌(Zn~(2+)),其中Aspergillus sp. B6-3对La~(3+)和锌Zn~(2+)的吸附率最高,分别为19.7%和3.9%。【结论】该研究为利用真菌去除稀土和重金属以优化生物吸附过程导向的环境生物修复和保护策略提供了机制基础。     

离子液体优化高速逆流色谱法分离槐花中的黄酮类化合物

应用高速逆流色谱法首次从槐花中一步分离出2种黄酮类化合物,并利用离子液体提高分离效果。以正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水-冰醋酸(1∶1∶1∶1∶0.05,v/v)为两相溶剂体系,从50 mg槐花粗提物中一步分离得到芦丁18.2 mg,槲皮素9.6 mg,其纯度均在97%以上。加入离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟化硼酸([BMIM][PF6]),使出峰时间由原来的85 min提前到55 min,分离度由0.9提高到1.8,达到完全分离,分离效果得到明显提高,为离子液体在高速逆流色谱中的进一步应用提供依据。     

从自然保护区到国家公园体制试点: 三江源国家公园环境覆盖的变化及其对两栖爬行类保护的启示

三江源地区具有丰富的高原生物多样性, 是我国重要的生态安全屏障。作为我国第一个体制试点的国家公园, 三江源国家公园将被建成青藏高原大自然保护展示和生态文化传承区。为更好地服务于三江源国家公园建设, 本研究从海拔、年均温和年降水等方面, 在环境空间上系统比较了国家公园与三江源和可可西里自然保护区的差异; 以4种两栖爬行动物即高原林蛙(Rana kukunoris)、倭蛙(Nanorana pleskei)、西藏齿突蟾(Scutiger boulengeri)和青海沙蜥(Phrynocephalus vlangalii)分布点环境条件在国家公园内外的异同为例, 探讨分布受环境制约大、扩散能力弱的物种保护在国家公园建设中可能面临的机遇和挑战。结果表明, 国家公园与已建自然保护区在地理空间上重叠较大, 但它们在自然环境上的差别很明显; 自然保护区内两栖爬行类所偏好的环境条件较多未包含在国家公园内。鉴于三江源的区位特殊性及对气候变化的敏感性, 区域内两栖爬行动物等对环境依赖性强、扩散能力弱物种的有效保护不仅有助于保持物种遗传多样性和区域生态系统的完整性, 也有利于更好地实现国家公园目标定位并服务于生态文明建设。为此, 在国家公园内, 应开展两栖爬行动物种群动态和群落结构的长期监测, 加强基础生物学研究, 掌握环境变化对两栖爬行动物分布、遗传、行为、形态、种群动态及群落可能产生的影响, 实现区域内两栖爬行动物及其类似物种在环境变化下的永续生存。