平滑肌肌球蛋白轻链激酶及ATP结合位点突变体对ATP酶活性的调节作用

目的：探寻MLCK的非激酶活性区域对MLCK活性的影响,进一步阐明MLCK的非激酶活性在调节平滑肌收缩过程中的分子机制。方法：利用编码MLCK全长的pColdI表达载体对其ATP结合位点进行定点突变,获得无激酶活性的MLCK突变体;应用Glycerol—PAGE鉴定肌球蛋白磷酸化水平;应用孔雀绿方法检测重组MLCK对肌球蛋白ATP酶活性的影响。结果：MLCK／△ATP（突变型）失去磷酸化肌球蛋白轻链的激酶活性;重组MLCK（野生型）和MLCK／AATP（突变型）均可以在非钙条件下激活非磷酸化肌球蛋白Mg2＋-ATP酶活性,抑制磷酸化肌球蛋白的Mg2＋．ATP酶活性,而且激活与抑制作用均随着MLCK浓度的增加而增大,但二者对肌球蛋白的ATP酶活性的作用没有显著差异（P〉0．05）。结论：平滑肌肌球蛋白轻链激酶及ATP结合位点突变体具有激活非磷酸化肌球蛋白ATP酶活性的作用。     

平滑肌肌球蛋白轻链激酶N端删除载体的构建

目的:构建重组平滑肌肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)N端删除栽体,为研究平滑肌MLCK的分子机制提供研究模型.方法:以重组质粒pCoid/155为模板,根据其待删除序列(N端1-41个氨基酸)设计上下游引物,行PCR扩增.将扩增片段以NdeI/EeoRl双酶切,产物行琼脂糖凝胶电泳回收得到目的基因.将目的基因与栽体连接,转化至大肠杆菌.筛选阳性克隆,并对阳性克隆进行测序.结果:用NdeI和EcoRI双酶切重组质粒pCold/155,琼脂糖凝胶电泳显示得到约4.4kb栽体和约3.4kb的MLCK片段.阳性克隆经测序证实MLCK的N端41个氨基酸序列已被成功删除.结论:成功构建了重组MLCK N端删除栽体 pCold/155/D41.     

miR-let-7b慢病毒载体促进大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化

微小RNA在生命体生长、衰老的过程中起着重要的作用,参与骨髓间充质干细胞(MSCs)重要的生物学进程,包括增殖、分化、信号转导和死亡等。该文探讨了miR-let-7b对MSCs来源神经细胞的调控作用。体外分离、扩增大鼠MSCs,通过细胞形态学观察、表面标志物的流式细胞仪检测进行鉴定。将MSCs分为miR-let-7b+组、miR-let-7b-组和对照组,分别转染miR-let-7b慢病毒载体、Anti-rno-miR-let-7b Inhibitor载体及不进行任何转染操作,实时荧光定量PCR(RTq PCR)检测各组细胞miR-let-7b的表达水平,确认转染情况。多因子联合法诱导各组MSCs向神经细胞分化,RT-q PCR检测神经细胞标志物MAP-2的表达,免疫细胞化学染色检测神经原特异性烯醇化酶(NSE)的表达和各组MSCs的神经细胞分化率。分离培养的MSCs在镜下呈长梭形或成纤维细胞样,CD90、CD44阳性表达率均大于90%,CD45的表达不足2%,证实得到的细胞即为MSCs。RTq PCR结果显示,与对照组相比,miR-let-7b+组的miR-let-7b表达水平升高,miR-let-7b-组几乎未检测到miR-let-7,提示miR-let-7b载体及miR-let-7b Inhibitor载体均成功转染了MSCs。经诱导分化后,与对照组相比,miR-let-7b+组神经细胞标志蛋白SIM312、Gap43、MBP和NSE与对照组相比表达水平显著升高(P0.05);miR-let-7b-组SIM312、Gap43、MBP和NSE表达水平与miR-let-7b+组相比具有明显差异(P0.05)。结果提示,miR-let-7b可以促进MSCs向神经细胞分化,通过控制miR-let-7b的水平可以调控MSCs的神经细胞分化率。     

冷藏温度及时间对稻螟赤眼蜂品质的影响

稻螟赤眼蜂Trichogramma japonicum Ashmead是水稻螟虫的重要卵寄生性天敌,对水稻螟虫的自然种群有着一定的控制作用。本文以稻螟赤眼蜂预蛹期作为冷藏时期,在0、3、6、10℃4个温度和0、5、10、15、20、25、30 d 7个冷藏时间条件下,以羽化率、雌蜂百分率、寄生米蛾卵数量、雌蜂寿命、种群趋势指数作为指标,调查了冷藏对稻螟赤眼蜂品质的影响。研究表明,在4个温度下,稻螟赤眼蜂各指标均随着冷藏时间的增加而降低。各冷藏温度中,以0℃最为敏感,冷藏至5 d时,羽化率(38.11%)和寄生米蛾卵数量(19.4粒)显著低于未冷藏处理;冷藏至15 d时,雌蜂寿命由3.1 d降至1.9 d,种群趋势指数由23.36下降至1.07。10℃下,稻螟赤眼蜂各指标下降最为缓慢,冷藏至10 d时,羽化率(85.35%)和寄生米蛾卵数量(24.3个)与冷藏0 d的差异不显著;冷藏至15 d时,雌蜂寿命(2.7 d)与冷藏0 d的差异也不显著,种群趋势指数为12.52。综合各指标,工厂化繁殖稻螟赤眼蜂时,其适宜冷藏温度为10℃,冷藏时间为10 d。