犬细小病毒NS1 非结构蛋白可诱导细胞凋亡

【目的】研究犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)非结构蛋白NS1在CPV引起宿主细胞凋亡中的作用,初步探讨CPV引起细胞凋亡的机制。【方法】首先采用PCR方法从犬细小病毒基因组中扩增NS1编码基因,然后利用pcDNA3.1A质粒构建NS1真核表达载体pcDNA-NS1,并通过HEK293FT细胞瞬时表达NS1重组蛋白,用Western-blot检测以确定重组NS1蛋白能否在真核细胞中表达。然后用CPV感染和用pcDNA-NS1表达载体转染F81宿主细胞,通过AnnexinV/PI双染法检测磷脂酰丝氨酸外翻和通过化学发光法检测caspase-3/7活性,分析感染CPV或转染NS1基因对F81宿主细胞凋亡的影响。【结果】结果表明,本实验扩增的NS1基因序列与GenBank的序列一致,构建的表达载体结构正确,并能够介导NS1基因在真核细胞中表达。感染CPV和转染NS1基因均能诱导F81细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻和明显提高细胞内caspase-3/7的活性,表明CPV和NS1蛋白均能引起细胞的凋亡。【结论】CPV诱导宿主细胞凋亡与其编码的NS1非结构蛋白有关。     

基于DTTD-MCR-PLUS模型的三生空间格局优化——以长沙市为例

优化三生空间格局有助于实现区域国土空间可持续高质量发展。研究提出利用动态交通时间数据优化最小阻力成本模型指标体系，对生态累计最小阻力与生活最小累计阻力差值进行聚类分析，利用突变点对各情景下的三生空间数量进行优化，从生活扩张、生态优先及基于资源与环境承载力视角下的粮食安全3个方面，提出了一种基于DTTD-MCR-PLUS的三生空间格局优化方法。研究发现：1) 基于动态数据优化的长沙市生态功能优化分区结果显示生态空间保护核心区面积为4111.41 km2，生态空间保护边缘区面积为2285.29 km2，生产空间开发重点区面积为2144.79 km2，生产空间开发边缘区面积为1928.59 km2，生活空间扩张集中区面积为1235.55 km2； 2) 耦合DTTD-MCR-PLUS模型模拟的多情景结果表明：生活优先情景下，生活空间面积增幅高达43.57%，主要分布在望城区南部，长沙县西部和雨花区东部；生态优先情景下，生态空间转出速度最低，与生活优先情景相比下降了3.11%；粮食安全情景下，生产空间侵占生态空间速度加快，增幅高达58.79%；3) 协调基本农田、生态保护红线、以及自然保护区下的2030 年长沙市三生空间格局优化布局方案结果表明：生产空间、生活空间和生态空间比例分别为37.63%、7.67%和54.70%。     

腺病毒介导犬干扰素-γ基因的表达及其体外抗犬细小病毒的作用

[目的]构建含犬干扰素-γ(c IFN-γ)基因的重组腺病毒,并在培养的犬肾细胞MDCK中分析其抗犬细小病毒的活性.[方法]首先将cIFN-γcNDA基因克隆到腺病毒穿梭质粒中,构建成含cIFN-γ基因的腺病毒穿梭质粒pShuttle3-cIFN-γ.利用特异的酶切位点,通过直接连接法将cIFN-γ表达盒插入到腺病毒基因组质粒pAdeno-X中,构建成含cIFN-γ基因的腺病毒基因组质粒pAd-cIFN-γ.pAd-cIFN-γ质粒经酶切线性化后转染人胚胎肾细胞HEK293T,在细胞中拯救出含有cIFN-γ基因的复制缺陷型重组腺病毒.然后用该重组腺病毒处理(感染)培养的犬肾细胞MDCK,再用犬细小病毒感染重组腺病毒处理的细胞,分析重组腺病毒在体外抗犬细小病毒的活性.[结果]通过连接法构建了含cIFN-γ基因的重组腺病毒,构建的重组腺病毒能够介导cIFN-γ在MDCK细胞中进行分泌表达.用含cIFN-γ基因的重组腺病毒处理MDCK细胞,可明显地抑制犬细小病毒在细胞中的增殖,表明构建的重组腺病毒具有明显的抗犬细小病毒的活性.[结论]构建了含cIFN-γ基因的重组腺病毒,并证明该重组病毒在体外具有明显的抗犬细小病毒的活性.     

重组猪肺表面活性蛋白A在体外可抑制PRRSV感染宿主细胞

【目的】研究重组猪肺表面活性蛋白A(SP-A)在体外对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染的抑制作用。【方法】采用PCR方法从含有猪SP-A基因的质粒中扩增SP-A基因,并将其插入到含有人CD5信号肽序列的真核表达载体pcDNA3.1A-CD5中,构建成SP-A基因的真核分泌型表达载体pcDNA-CD5-SPA/MH。将重组表达载体通过磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行瞬时表达,通过Western blot方法鉴定表达产物,采用Ni-NTA琼脂糖凝胶亲和层析法从培养基中分离和纯化重组SP-A蛋白,通过ELISA方法检测SP-A蛋白与PRRSV的结合活性。将SP-A蛋白与PRRSV孵育,然后感染MARC-145细胞和猪肺泡巨噬细胞,感染72 h后测定病毒滴度,分析重组SP-A蛋白对PRRSV感染的抑制作用。【结果】结果表明构建的真核表达载体能够介导SP-A基因在HEK293T细胞中进行分泌表达;表达的重组猪SP-A蛋白能够与PRRSV进行剂量依赖性结合;用重组猪SP-A蛋白与PRRSV进行孵育,然后感染MARC-145细胞和猪肺泡巨噬细胞,结果显示SP-A处理的PRRSV感染细胞后的病变程度明显低于对照组。感染72 h后,SP-A处理组的PRRSV在MARC-145细胞和猪肺泡巨噬细胞的滴度明显低于SP-A非处理组。【结论】重组猪SP-A在体外对PRRSV的感染有明显的抑制作用,揭示SP-A具有抗PRRSV的活性。     

IL-2与IL-7基因对犬细小病毒VP2 DNA疫苗在小鼠的免疫增强作用

[目的]探讨犬白细胞介素-2(cIL-2)与犬IL-7(cIL-7)基因对犬细小病毒(CPV) VP2蛋白DNA疫苗免疫增强的协同作用.[方法]利用含内部核蛋白体进入位点( IRES)的真核表达载体构建cIL-2和cIL-7双基因表达载体.然后利用本实验室构建的CPV VP2、cIL-2和cIL-7表达载体及本文构建的双基因表达载体,以不同组合对小鼠进行免疫,即VP2单免疫,VP2+cIL-2、VP2+cIL-7和VP2+cIL-2/cIL-7共免疫.通过ELISA方法检测免疫后不同时间小鼠血清VP2的抗体水平,并分析中和抗体的效价,通过细胞增殖实验检测免疫后小鼠脾脏淋巴细胞的增殖反应,并用ELISA方法测定小鼠淋巴细胞γ干扰素的表达水平.[结果]本实验构建的双基因表达载体结构正确,并能够介导cIL-2与cIL-7基因在真核细胞中进行同步分泌表达.小鼠免疫结果表明,VP2+cIL-2/cIL-7共免疫组小鼠血清的抗体滴度和中和抗体效价均显著高于VP2 +cIL-2和VP2+cIL-7共免疫组(P＜0.05).VP2+cIL-2/cIL-7共免疫组小鼠的淋巴细胞刺激指数比其它免疫组略有升高但尚未达到显著水平,然而γ干扰素的表达水平显著高于其它免疫组(P＜0.05).[结论]cIL-2和cIL-7基因对CPV VP2 DNA疫苗免疫原性的增强作用具有明显的协同效应.