具有抗HIV活性的天花粉蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

目的:天花粉蛋白(TCS)有较强的抗HIV活性。利用基因工程技术在大肠杆菌中表达TCS并进行纯化。方法:从新鲜栝楼叶片中获取TCS基因组DNA,利用PCR技术扩增其全长基因,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后与原核表达载体pRSET-A连接,转化感受态E.coliDH5α,提取质粒进行酶切鉴定及测序;将所获阳性重组质粒转化感受态E.coliBL21(DE3)得到工程菌,经IPTG诱导表达后,对表达产物进行SDS-PAGE及Western印迹鉴定;用Ni-NTA柱对所获目的蛋白进行纯化。结果:获得了目的蛋白的可溶性高效表达,并通过了Western印迹鉴定。经Ni-NTA柱纯化后,得到大量均一的6His-TCS融合蛋白。结论:TCS在大肠杆菌中的表达与纯化,为通过基因工程方法研制具有抗HIV活性的药物奠定了基础。     

恒磁场增强心肌梗死大鼠骨髓间充质干细胞移植后心脏功能改善

目的：研究恒磁场对心肌梗死大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs）移植后心脏功能的影响。方法：取180g,9-12周龄雄性SD大鼠骨髓,以密度梯度离心分离出单个核细胞（MNCs）,于体外培养并传代培养出骨髓间充质干细胞（MSCs）。制作大鼠心肌梗死模型,将1.5×106BMSCs注射入梗死梗死区周围,分为磁场照射＋BMSCs植入组、BMSCs植入组及空白对照组。4周后处死动物,每组5只大鼠。磁场照射组用0.4 T恒磁场置于心前区30 min,每日1次,共7天。用颈动脉插管法测定心脏功能,Masson三色染色测定梗死面积,VWF VIII染色计算血管密度。结果：与对照组相比BMSCs组以及磁场组均可以显著提高左心室收缩压（LVSP）,dp/dtmax以及-dp/dtmax,减少LVEDP（P〈0.05）。但是,磁场组与BMSCs组相比LVSP,左心室内压最大上升速率（dp/dtmax）以及左心室内压最大下降速率（-dp/dtmax）增高,左心室舒张末压（LVEDP）减少（P〈0.05）。与对照组相比BMSCs组以及磁场组均可以显著提高减少心梗面积（P〈0.05）。磁场组与BMSCs组相比心梗面积减少（P〈0.05）。与对照组相比BMSCs组以及磁场组均可以显著提高增加血管密度（P〈0.05）。磁场组与BMSCs组相比血管密度增加（P〈0.05）。结论：恒磁场具有加强移植BMSCs改善心脏功能的作用。     

表达CCR5Delta32基因对人外周血单核细胞增殖功能的影响

目的：在人外周血单核细胞（PBMC）内表达CCR5Delta32基因,研究是否对该细胞增殖功能产生影响。方法：构建pLenti-CCR5Delta32慢病毒载体,包装后产生重组慢病毒,将其转染PBMC,荧光显微镜观察转染情况,Westernblot鉴定目的蛋白的表达;分别用植物血凝素（PHA）及破伤风类毒素（TTD）刺激培养经转染的靶细胞,采用MTT比色法测定其增殖功能是否受影响。结果：构建了pLenti-CCR5Delta32慢病毒载体,经包装后产生重组慢病毒,滴度约为5×105TU/mL。将其转染PBMC,观察到约半数PBMC胞浆内有绿色荧光蛋白表达,经Westernblot进一步鉴定为目的蛋白;转染的靶细胞经PHA或TTD刺激培养后,有着与正常PBMC相似的增殖功能。结论：构建了重组慢病毒并将其转染PBMC靶细胞,为获得性免疫缺陷综合征的基因治疗研究奠定了基础。     

带有穿膜结构域的转录因子蛋白Oct4和Sox2的融合表达

目的:克隆、表达及纯化带有穿膜结构域的转录因子蛋白Oct4和Sox2。方法:根据GenBank中的Oct4和Sox2基因序列,在其3’端引入穿膜结构域11R,并在其两端引入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点,进行全基因合成;将目的基因克隆至pET41a载体,进行酶切鉴定及测序;将所获阳性重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,对表达产物进行Western印迹鉴定;最后用Ni-NTA亲和层析柱对所获目的蛋白进行纯化。结果:质粒酶切鉴定结果表明带有目的基因的重组质粒构建成功;SDS-PAGE结果显示有相对分子质量约42×103和38×103的特异性蛋白表达条带,经Western印迹证实为目的蛋白;用Ni-NTA亲和层析柱纯化后,得到均一的Oct4和Sox2目的蛋白。结论:得到带有穿膜结构域的转录因子融合蛋白Oct4和Sox2,为今后安全开展诱导性多能干细胞研究奠定了基础。     

恒磁场抑制缺血缺氧条件下大鼠骨髓间充质干细胞凋亡

目的:研究恒磁场对体外缺血缺氧培养条件下大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs) 凋亡的影响并探讨其作用机制.方法:采取大鼠骨髓,以密度梯度离心分离出单个核细胞(MNCs),于体外培养并由牛垂体提取物(PEX)诱导扩增传代培养出骨髓间充质干细胞(MSCs).经形态学和流式细胞仪检测MSCs表面标志物鉴定后,将骨髓间充质干细胞(BMSCs)在缺血缺氧条件下培养,通过TUNEL检测比较不同组别细胞的凋亡率和蛋白印迹法(western blot)来观察细胞中特定蛋白质的变化.结果:①经形态学观察和流式细胞仪检测MSCs表面标志物鉴定,提示骨髓间充质干细胞培养成功.②缺血/缺氧组与缺血/缺氧+磁场组比较,缺血缺氧组的凋亡率显著性增加,Akt磷酸化水平显著上升(P＜0.05).提示恒磁场可以使PI3K(Phosphoinositide-3kinase)/Akt(ProteinkinaseB,PKB)信号通路被激活而抑制凋亡的发生.结论:恒磁场通过激活PI3K/Akt信号通路抑制体外缺血缺氧条件下培养的骨髓间充质干细胞的凋亡.     

转基因在玉米中的遗传分离与整合特性的研究

用ＰＣＲ和ＤＮＡ分子杂交方法研究了转基因Ｂｔ在３种不同方法获得的８个转化体后代中的遗传分离、整合性质及其稳定性,结果表明：（１）转基因在大多数转化体后中呈简单的孟德尔遗传;在Ｒ１至Ｒ２代,部分家系中转化体比例偏低,有的发生转基因丢失,但到Ｒ３代以后均趋于正常的孟德尔遗传方式,在群体中固定下来;（２）转基因在不同转化体中的整合类型有一定差异,但整合的位点和拷贝数都较少,且多呈串联或紧密连锁的整合;（     

表达CCRSDelta32基因对人外周血单核细胞增殖功能的影响

目的:在人外周血单核细胞(PBMC)内表达CCR5Delta32基因,研究是否对该细胞增殖功能产生影响.方法:构建pLenti-CCRSDelta32慢病毒载体,包装后产生重组慢病毒,将其转染PBMC,荧光显微镜观察转染情况,Western blot鉴定目的蛋白的表达;分别用植物血凝素(PHA)及破伤风类毒素(TTD)刺激培养经转染的靶细胞,采用M1tr比色法测定其增殖功能是否受影响.结果:构建了pLenti-CCRSDelta32慢病毒载体,经包装后产生重组慢病毒,滴度约为5×106TU/mL.将其转染PBMC,观察到约半数PBMC胞浆内有绿色荧光蛋白表达,经Westem blot进一步鉴定为目的蛋白;转染的靶细胞经PHA或TTD刺激培养后,有着与正常PBMC相似的增殖功能.结论:构建了重组慢病毒并将其转染PBMC靶细胞,为获得性免疫缺陷综合征的基因治疗研究奠定了基础.     

载脂蛋白E基因多态性检测对ACS患者降脂疗效的影响

目的:探究载脂蛋白E(ApoE)基因多态性检测在急性冠脉综合征(ACS)患者降脂治疗的中应用价值。方法:选取2019年2月~2020年6月180例ACS患者,采用随机数字表法分为A、B、C共3组各60例,各组患者均接受ApoE基因多态性检测,并根据Sanger法测序判断ApoE基因表型(E2、E3、E4表型),A组予以瑞舒伐他汀口服(10 mg/d),B组予以瑞舒伐他汀强化治疗(20 mg/d),C组予以瑞舒伐他汀(10 mg/d)+依折麦布(10 mg/d)口服,连续治疗1个月,评价3组各基因表型血脂[总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)]改善情况、LDL-C达标率,记录药物副反应,所有患者随访1个月,统计心血管不良事件(MACE)发生情况。结果:3组ApoE基因E2、E3、E4表型构成比无显著差异(P>0.05)。治疗后,各组不同ApoE基因表型TC、TG、LDL-C水平均较治疗前下降,且变化率比较差异有统计学意义(P<0.05),表现为E2型>E3型>E4型;其中,3组E2表型TC、TG、LDL-C水平变化率无显著差异(P>0.05);B组、C组E3表型TC、TG、LDL-C水平变化率均显著高于A组(P<0.05),但B组、C组各指标变化率比较差异无统计学意义(P>0.05);3组E4表型TC、TG、LDL-C水平变化率比较差异有统计学意义(P<0.05),且表现为C组>B组>A组。治疗后,A组LDL-C达标率为61.67%,显著低于B组的85.00%、C组的90.00%(P<0.05);其中,3组E2表型LDL-C达标率比较无显著差异(P>0.05),A组E3表型LDL-C达标率显著低于B组、C组(P<0.05),A组、B组E4表型LDL-C达标率低于C组(P<0.05)。治疗期间,仅B组出现1例ALT超出正常上限3倍,停药后可恢复正常。3组MACE发生率比较差异有统计学意义(P<0.05),表现为A组发生率18.33%明显高于B组5.00%、C组3.33%(P<0.05),但3组E2、E4型MACE发生率均无明显差异(P>0.05),而A组E3型MACE发生率高于B组、C组(P<0.05)。结论:ACS患者降脂疗效与ApoE基因表型有关,对E2表型单用瑞舒伐他汀即可取得良好降脂效果,对E3表型强化瑞舒伐他汀或联合依折麦布治疗较单用瑞舒伐他汀均能提高降脂效果,而对E4表型联合依折麦布降脂效果优于单用瑞舒伐他汀或强化治疗。     

不同比例输血策略对创伤-失血性休克大鼠的凝血指标、血浆代谢指标影响及作用机制分析

摘要 目的：探讨不同比例输血策略对创伤-失血性休克大鼠的凝血指标、血浆代谢指标影响及作用机制。方法：选择Sprague- Dawley大鼠24只,制备创伤-失血性休克动物模型,采用血气分析仪检测凝血指标（PT及ATPP）血气分析指标（包括pH、PO₂、PCO₂、乳酸）,采用比色法检测常见代谢酶活性,采用PCR法检测mRNA含量,记录并对比目标血压为80 mmHg时B、C、D三组大鼠的输血量。结果：与A组大鼠相比,B、D组大鼠的ATPP、PT水平明显较高(P<0.05),A组与C组间对比无统计学意义(P>0.05);与B组大鼠相比,D组大鼠的ATPP、PT水平明显较低(P<0.05)。与A组相比,B、C、D组大鼠的pH、PO₂水平明显降低、PCO₂及乳酸水平明显升高对比(P>0.05);与B组大鼠相比,C、D组大鼠的pH、PO2明较高,PCO2、乳酸明显较低(P<0.05);C、D组间对比无统计学意义(P>0.05)。四组大鼠的血浆肌酸激酶、天门冬氨酸基转移酶、碱性磷酸酶、丙氨酸氨基转移酶活动水平对比无统计学意义(P>0.05)。与A组相比,B、D组大鼠的血浆miR-24水平明显较高,肝脏FX mRNA水平明显较低(P<0.05),C组大鼠的血浆miR-24与肝脏FX mRNA与A组对比无统计学意义(P>0.05);与B组相比,D组大鼠的血浆miR-24水平明显较低,肝脏FX mRNA水平明显较高(P<0.05)。达到目标血压为80 mmHg时,输血量B组>C组>D组(F=133.139,P<0.001)。结论：新鲜冰冻血浆：红细胞比为1:1的输血策略较1：2.5的输血策略对创伤-失血性休克大鼠的复苏效果更好,可能与其降低大鼠的循环miR-24水平,提高肝脏FX mRNA水平表达有关。     

2，4_D对甘薯体细胞胚胎发生的调控

将来源于‘徐薯１８’叶片的胚性愈伤组织,接种在含有不同２,４Ｄ浓度的液体ＭＳ培养基中进行悬浮培养,悬浮细胞表现出不同的形态结构、分裂方式和发育途径：２,４Ｄ浓度为１ｍｇ／Ｌ时,细胞均等分裂,增殖迅速;不含２,４Ｄ时,细胞多进行不均等分裂,并发育成体细胞胚。不同２,４Ｄ浓度中培养的悬浮细胞,其胞外过氧化物同工酶谱及其随时间变化的方式有很大差异,并与细胞的生长、发育过程密切相关