FGF受体-1和FGF受体-2介导成纤维细胞生长因子-21信号传导

成纤维细胞生长因子-21是FGF家族成员,FGF-21与其他FGF家族成员不同,它没有促进细胞分裂的作用,但具有很强的调节血糖作用.本实验旨在系统研究FGF-21的功能受体,以及配体/受体的作用机制,为深入研究FGF-21的生物功能,加快FGF-21从基因到药物的转变奠定理论基础.前期实验表明,FGF-21促进3T3-L1脂肪细胞葡萄糖代谢,对前脂肪细胞无作用,说明3T3-L1脂肪细胞表达FGF-21功能受体.本文以3T3-L1脂肪细胞为靶标,深入研究FGF-21的功能受体.在FGF-21作用下3T3-L1脂肪细胞中的FGF受体1(R1)和FGF受体2(R2)形成特异性异源二聚体.脂肪细胞经FGF-21处理后,R1和R2均迅速发生磷酸化,表明两个受体均被FGF-21激活.siRNA干涉实验表明,抑制R1和R2功能可以抑制FGF-21处理后3T3-L1脂肪细胞Glut1的表达水平,揭示了FGF-21通过R1和R2上调3T3-L1脂肪细胞中Glut1的表达.免疫印迹结果表明,FGF-21可以介导3T3-L1脂肪细胞表面R1和R2的内吞.克隆后测序分析结果表明,3T3-L1脂肪细胞表达的FGF受体为FGFR-1Ⅲc和FGFR-2Ⅲc.结果表明,FGFR-1Ⅲc和FGFR-2Ⅲc是FGF-21的功能受体,参与FGF-21在脂肪细胞中介导的糖代谢活性的信号传导.     

融合蛋白GST-Ulp1p在大肠杆菌中的高效可溶性表达及其活性鉴定

利用基因工程技术,体外重组小分子类泛素修饰蛋白酶1(Ulp1)的活性片段,获得高表达、高特异性重组蛋白酶。从酿酒酵母Saccharomyces cerevisia中提取Ulp1编码第403到621个氨基酸残基之间的DNA片段(Ulp1p),在其C端加入6×His并连接到大肠杆菌表达载体pGEX中,构建重组表达质粒pGEX-Ulp1p-his6。将重组质粒转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)中,氨苄青霉素抗性筛选转化子。表达、纯化后,以SUMO融合蛋白检测其活性。经过优化,该蛋白可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的40.12%。可通过谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱或Ni-NTA凝胶亲和层析纯化得到纯度98%的蛋白。经酶切分析,比活力为1.375×104U/mg。融合蛋白GST-Ulp1p-His6无需切除谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签,具有很高的活性,制备简易;6×His标签,有利于底物蛋白切割后纯化,减少蛋白损失。本研究为制备高活力的SUMO蛋白酶提供了一个新方法。