一种构建马链球菌兽疫亚种血红素受体基因缺失突变株的方法

【目的】探讨一种构建马链球菌兽疫亚种基因缺失突变株的方法。【方法】PCR扩增目的基因,用pJR700温度敏感载体系统,构建目的基因载体;反向PCR扩增目的基因缺失载体片段,连接,产生目的基因缺失载体;电转化缺失重组质粒导入感受态细胞,先在37℃卡拉霉素(kan)培养基中连续培养,然后在30℃不含kan液体培养基中传代,挑取抗生素敏感菌落,PCR扩增检测抗生素敏感菌染色体上目的基因片段和链黑霉素抗性实验确认血红素受体基因缺失。【结果】获得不含抗生素基因的马链球菌兽疫亚种血红素受体基因缺失突变株。【结论】用pJR700温度敏感载体系统,构建马链球菌兽疫亚种基因缺失突变株是可行的。     

大黄酸抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌机制

【背景】耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus,MRSA)是医院及社区常见的机会性致病菌,具有多重耐药性、高发病率和高死亡率的特点。MRSA感染已成为全球医学界的普遍难题之一。【目的】研究大黄酸对MRSA的抗菌机制。【方法】以二倍稀释法测定大黄酸对MRSA的最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC);通过MIC测定大黄酸对MRSA动态抑菌作用;建立生物膜模型,测定大黄酸在生物膜屏障下对生物膜内存活菌的影响,并通过扫描电镜观察不同浓度大黄酸作用后的MRSA菌体形态变化;用免疫荧光染色法、荧光分析法测定大黄酸对MRSA细胞质膜去极化和细胞膜通透性的影响。【结果】大黄酸对MRSA的MIC为8μg/mL;大黄酸能对生物膜内存活菌有明显的抑制作用,而且在大黄酸作用下菌体的形态发生明显皱缩和破损,破损严重程度与浓度呈正相关;随着大黄酸浓度和作用时间的增加,荧光强度出现明显变化,细胞膜的通透性发生改变。【结论】大黄酸主要通过损伤细菌的细胞膜,从而抑制细菌的生长和繁殖。     

构建无抗性标记双拷贝透明质酸合成酶基因工程菌

【目的】探讨一种构建无抗生素选择标记链球菌透明质酸合成酶基因工程菌的方法。【方法】PCR扩增链球菌透明质酸合成酶操纵子hasABC基因,用温度敏感载体pJR700构建携带hasABC基因重组质粒pXL32;电转化pXL32质粒到马链球菌兽疫亚种感受态细胞,卡那霉素(Kanamycin,kan)平板37℃培养筛选重组子,在不含kan液体培养基中30℃传代,37℃平板分离挑取抗生素敏感菌落,RT-PCR检测工程菌染色体hasABC基因表达,Bitter-Muir法测定菌体透明质酸含量。【结果】在无抗生素选择压力条件下,获得透明质酸产率提高34%的马链球菌兽疫亚种透明质酸合成酶基因工程菌。【结论】用pJR700温度敏感载体系统,构建能提高透明质酸产量的无抗生素选择标记的基因工程菌是可行的。