1.4-Naphthoquinone与兔骨肌肌质网钙通道相互作用表现出的双相特性

利用Ｃａ２＋浓度动态光谱法和［３Ｈ］－ＲｙａｎｏｄｉｎｅＢｉｎｄｉｎｇ法,对具有特异氧化硫醇基团的抗肿瘤剂１,４－Ｎａｐｈｔｈｏｑｕｉｎｏｎｅ（１,４ＮＱ）与兔骨肌肌质网（ＳＲ）钙通道（ＲｙＲ）的作用机制进行了研究．探讨了氧化态１,４ＮＱ激发载钙ＳＲ囊泡的Ｃａ２＋释放机制,并首次揭示出１,４ＮＱ对ｒｙａｎｏｄｉｎｅｂｉｎｄｉｎｇ的影响具有强烈依赖于浓度和时间的双相特性。实验结果表明,ＲｙＲ蛋白上至少存在两个硫醇调控部位,它们的氧化还原态决定着ＲｙＲ的门控功能。这个结果对ＲｙＲ氧化还原模型是一个新发展。     

调控剂的电子传递性质对骨骼肌型钙释放通道的调控效应研究

肌质网(sarcoplasmic reticulum,SR)中的钙释放通道利阿诺定受体(ryanodine receptor,RyR)是调控胞浆钙离子浓度的重要蛋白,其活性受多种调控剂影响．调控剂的不同电子传递性质可能作用于RyR的功能性巯基,进而影响其门控状态．了解具有不同电子传递性质的调控剂影响钙通道的作用机制具有重要意义．本研究采用光子相关光谱法(PCS)、CPM(7-二乙 基-3-(4′-马来酰亚胺苯基)4-甲基香豆素)荧光标记法及[³H]-ryanodine结合等实验,分别检测多种调控剂对RyR1的蛋白及复合体粒度分布、自由巯基量及对通道状态的影响,利用光漂白法检测各调控剂的电子传递性质．结果显示,激活剂和巯基氧化剂具有类似电子受体的性质并产生相似作用,即自由蛋白粒度增加,自由巯基量减少,具有激活通道作用;抑制剂和巯基还原剂则具有类似电子供体的性质,作用效果相反．     

弱极低频磁场对Actin骨架组装效率的频率窗口效应初探

前期研究发现,50 Hz弱磁场辐照能明显降低细胞的微丝含量和组装效率,对actin骨架形态也有明显影响.电磁生物学效应是否与辐照场频率相关,一直受到研究者的关注.单体球状肌动蛋白(G-actin)是带电结构,电磁场频率会影响其振荡频率并对微丝聚合效率产生影响.本文从细胞骨架形态和蛋白质两层次,采用免疫荧光技术考察0.4 m T,在35~140 Hz范围内5个频率的极低频磁场(ELF-MF)对FL细胞中纤维状肌动蛋白(F-actin)含量的影响,并采用荧光共振能量转移技术(FRET)验证效应最明显的频率对离体G-actin组装效率的干扰程度.结果显示,相比假辐照组,细胞中F-actin含量在50 Hz辐照组下降了(34.66±3.14)%,110 Hz次之,而另外3组(35、70和140 Hz)无显著性差异.同时利用FRET方法验证,在50 Hz磁场辐照下,离体环境中G-actin组装成F-actin的效率较假辐照组、35和70 Hz组显著降低.经初步分析,G-actin在弱ELF-MF中受到以洛伦兹力和感生电场力的合力为主的相关电磁力干扰,致使组装效率下降,且由于工频磁场周期与微丝组装周期的特殊相干性,在50 Hz频率附近可能存在一个外磁场干扰actin骨架组装的频率窗口.     

CPM抑制了由1,4NQ诱导的对骨肌肌质网 SR钙通道RyR1的激活效应

利用7－diethylamino-3-(4‘-maleimidylphenyl)-4-methylcoumarin(CPM)甲基化钙通道CPM能明显阻碍由1,4NQ诱导的对RyR1的激活,但对由1,4NQ产生的抑制没有明显作用。用经CPM预处理过和没有处理过的样品与1,4NQ温育手离心清洗,发现未经CPM处理的样品经激活和抑制浓度的1,4NQ温育后,离心清洗不能消除1,4NQ对RyR1的激活和抑制。而经CPM处理后的样品,在1,4NQ的激活浓度和抑制浓度下,离心清洗后 有观测到1,4NQ诱导的激活态,但抑制态仍然明显存在,以上结果说明,CPM所识别的特异活性硫醇参与了1,4NQ激活作用：CPM与此硫醇发生甲基化作用,因此阻断了1,4NQ对RyR1上的激活部位硫醇发生作用,使钙通道不能被激活。     

50 Hz弱磁场诱导离体表皮生长因子受体聚集

利用原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)观测到浓度为5滋g/mL离体表皮因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)蛋白在50Hz磁场作用下发生聚集,其颗粒呈现倍数变大和变高趋势;利用透射电镜(transmission electronic microscope,TEM)也得到类似的蛋白变大趋势。结果表明,在AFM和TEM下观察到,磁场作用后蛋白聚集颗粒的平均半高宽(平均直径)由(21.7±2.2)nm(12.5nm)增大到(33.0±4.0)nm(23nm),最可几高度由(1.42±0.18)nm增加到(3.08±0.17)nm。这种由磁场引起的聚集效应呈时间依赖性。利用Alexa-488-EGF标记EGFR观察了磁场暴露对细胞上EGF受体表达的影响,提示EGF受体的表达可能稍有上调。上述结果提示50Hz磁场信号可能通过影响EGFR的膜上聚集状态来影响下游信号通路。这种对信号通路的影响可能是电磁场生物性效应的一种机制。     

1,4萘醌和谷胱甘肽对Ryanodine受体初始结合率的影响及其意义

采用ｒｙａｎｏｄｉｎｅ 动态结合方法,考察了１,４ 萘醌（１,４ＮＱ） 和谷胱甘肽（ＧＳＳＧ） 作用于兔骨骼肌肌质网（ＳＲ）ｒｙａｎｏｄｉｎｅ 敏感钙通道（ＲｙＲ） 所产生的对ｒｙａｎｏｄｉｎｅ 初结合率（Ｒ０） 的影响。类似于１,４ＮＱ 对ｒｙａｎｏｄｉｎｅ 平衡结合的实验结果［７ ］ ,１ ,４ＮＱ 对Ｒ０ 也诱导出浓度依赖性的多相性变化规律,还原态１ , ４ＮＱ 的Ｒ０ 曲线则没有这种多相性。而ＧＳＳＧ 在３７°Ｃ 时所有浓度或时间区间都没有对ｒｙａｎｏｄｉｎｅ 结合对或Ｒ０ 诱导出明显的多相性行为;还原态的谷胱甘肽（ＧＳＨ） 亦只能产生出单相的抑制作用。这些氧化还原试剂也对ｒｙａｎｏｄｉｎｅ 结合率系数ｋ ＋ １ ,但不是ｋ － １ ,产生了相应的影响。