紫苏溶血磷脂酸酰基转移酶基因的克隆与功能分析

紫苏(Perilla frutescens)是一种重要食药同源油料作物,种子含油量高达46%−58%,其中α-亚麻酸(C18:3)含量占60%以上。溶血磷脂酸酰基转移酶(lysophosphatidic acid acyltransferase,LPAT)是植物种子三酰基甘油组装过程中的一类关键限速酶。本研究从紫苏发育种子中克隆了其编码基因(PfLPAT2),并利用qRT-PCR技术检测PfLPAT2基因在紫苏不同组织及不同发育时期种子的表达特性。构建PfLPAT2/GFP融合表达载体并通过农杆菌介导瞬时侵染本氏烟草叶片,检测PfLPAT2蛋白的亚细胞定位。构建大肠杆菌(Escherichia coli)表达载体、酵母表达载体和组成型植物过表达载体,分别转化大肠杆菌突变株SM2-1、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)野生型菌株INVSc1和普通烟草(Nicotiana tabacum),分析PfLPAT2蛋白的酶活性及生物学功能。结果表明,紫苏PfLPAT2基因ORF为1 155 bp,编码384个氨基酸。功能结构域预测显示PfLPAT2蛋白具有溶血磷脂酸酰基转移酶典型的保守区。PfLPAT2基因在紫苏根、茎、叶、花和开花后10、20、30、40 d的种子中均有表达,且在开花后20 d的种子中高表达。亚细胞定位结果显示PfLPAT2蛋白定位于细胞质。大肠杆菌功能互补测试表明,PfLPAT2可恢复SM2-1细胞膜脂生物合成,具有LPAT酶活性。与非转基因对照相比,转PfLPAT2基因酵母的总油脂含量显著提高,且脂肪酸各组分的含量发生改变,油酸(C18:1)含量增加明显,预示PfLPAT2对C18:1具有较高的底物偏好性。转基因烟草叶片总脂肪酸含量比对照组提高了约0.42倍,C18:1含量增加了约1倍。转基因株系总脂提高和脂肪酸组分的改变表明PfLPAT2异源表达可以促进宿主油脂合成和健康有益型脂肪酸(C18:1和C18:3)的积累。本研究为深入解析紫苏油脂特别是不饱和脂肪酸合成的分子调控机制和改良油料作物油脂品质提供理论依据和基因元件。     

紫苏油脂合成相关基因家族鉴定及表达分析

该研究从转录组数据库中筛选鉴定紫苏溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAT)家族基因,采用生物信息学方法分析了该家族基因的序列特征及蛋白结构,利用qRT PCR技术对该基因时空表达特性进行了研究,为进一步了解紫苏油脂合成机制提供理论依据。结果表明：(1)从紫苏转录组数据库中共检测出11个LPAT家族基因,分别命名为PfLPAT1、PfLPAT2 1、PfLPAT2 2、PfLPAT2 3、PfLPAT2 4、PfLPAT4 1、PfLPAT4 2、PfLPAT5 1、PfLPAT5 2、PfLPAT5 3和PfLPAT5 4;PfLPATs编码氨基酸长度介于250~384 aa之间,理论等电点在7.6~9.6之间。(2)基因序列比对结果表明,11个PfLPATs蛋白分别属于3个亚类,其中1型LPAT包含1个基因,2/3型LPAT 包含4个,4/5型LPAT 包含6个。(3)实时荧光定量PCR结果显示,11个LPAT家族基因在 ‘晋紫苏1号’不同组织中均有表达,其中LPAT2 1、LPAT2 2和LPAT2 3在种子中表达量较高,推测其在紫苏种子油脂合成代谢过程中发挥重要作用。该结果为后续紫苏LPAT家族基因的功能研究提供了重要的基因信息。     

紫苏硬脂酰-ACP脱氢酶基因家族鉴定及表达分析北大核心CSCD

硬脂酰-ACP脱氢酶(SAD)催化硬脂酸脱氢生成油酸,是形成不饱和脂肪酸的关键酶。该研究从紫苏转录组数据库中筛选鉴定紫苏硬脂酰-ACP脱氢酶(PfSAD)家族基因,并进行生物信息学分析及保守功能域分析,用qRT-PCR技术检测PfSADs各成员在不同组织中的表达特性,以探讨PfSAD家族基因在调控种子脂肪酸组分中的作用,为紫苏脂肪酸组分的遗传改良提供基因元件。结果显示:(1)从该课题组前期自测的紫苏转录组数据库中共检测出6个PfSAD家族基因,其编码蛋白的氨基酸长度介于367~396 aa之间,均具有SAD的保守结构域和二铁中心,预测其基因编码蛋白均定位于叶绿体。(2)多序列比对结果显示,紫苏PfSADs蛋白序列与拟南芥、蓖麻及可可等植物的SAD蛋白序列相似性均在50%以上;系统进化分析显示,6个紫苏SAD蛋白被分为3个亚组,其中第一个亚组包含PfSAD1,第二亚组包含PfSAD2、PfSAD3,第三亚组包含PfSAD4、PfSAD5和PfSAD6。(3)实时荧光定量PCR分析发现,PfSADs各成员在‘晋紫苏1号’不同组织中的表达量差异显著,其中PfSAD1主要在叶中表达,PfSAD2、PfSAD3、PfSAD4和PfSAD5在种子中表达量较高,PfSAD6在花中具有显著表达优势。研究表明,PfSADs具有典型的保守基序及催化SAD的活性中心,其各成员在不同的组织中高表达,推测这6个基因均参与了硬脂酰ACP(C18∶0-ACP)脱氢生成油酰基ACP(Δ9C18∶1-ACP)的过程,在紫苏油脂合成代谢过程中发挥重要作用。     

紫苏Pfgpat9基因的鉴定与功能分析

甘油三磷酸酰基转移酶(GPAT)是三酰甘油(TAG)合成过程中的关键酶。本研究从油料作物紫苏中筛选鉴定得到甘油三磷酸酰基转移酶基因Pfgpat9,并揭示其编码蛋白特征及基因功能。从紫苏转录组数据库中筛选获得gpat9基因片段,以优选品种‘晋紫苏1号’为材料,通过RT-PCR技术克隆获得该基因的开放阅读框(ORF)全长序列,命名为Pfgpat9;利用实时荧光定量PCR方法分析Pfgpat9基因在紫苏根、茎、叶、花及不同发育时期种子(开花后10、20、30、40 d)中的组织表达特性;通过双酶切将紫苏Pfgpat9基因完整的ORF序列连接到酵母表达载体pYES2.0上,将重组质粒转化至野生型酵母菌株INVSc1和缺陷型酵母gat1,并验证该基因的功能。结果显示:紫苏Pfgpat9基因ORF为1 116 bp,共编码371个氨基酸,理论等电点pI为8.96,不稳定系数为46.67,亲水性系数为-0.108,是一种亲水性不稳定蛋白。紫苏Pfgpat9基因具有典型的GPAT9功能结构域,包含3个典型的跨膜螺旋区;多序列比对分析表明,紫苏PfGPAT9蛋白与油橄榄、茶树和向日葵GPAT9蛋白的亲缘关系较近;qRT-PCR分析显示,Pfgpat9基因在紫苏不同组织中均表达,在种子发育不同时期表达量呈先升高后降低趋势,在开花后20 d表达量达到最高;酵母转化结果表明,转Pfgpat9基因野生型酵母和转Pfgpat9基因缺陷型酵母总脂含量均提高,且C16∶0、C16∶1含量均有所提高。研究表明,Pfgpat9基因在紫苏种子油脂合成积累过程中发挥重要作用,这为进一步通过基因工程及转基因技术改良紫苏品质提供了新的方向。