紫苏Pfgpat9基因的鉴定与功能分析

甘油三磷酸酰基转移酶(GPAT)是三酰甘油(TAG)合成过程中的关键酶。本研究从油料作物紫苏中筛选鉴定得到甘油三磷酸酰基转移酶基因Pfgpat9,并揭示其编码蛋白特征及基因功能。从紫苏转录组数据库中筛选获得gpat9基因片段,以优选品种‘晋紫苏1号’为材料,通过RT-PCR技术克隆获得该基因的开放阅读框(ORF)全长序列,命名为Pfgpat9;利用实时荧光定量PCR方法分析Pfgpat9基因在紫苏根、茎、叶、花及不同发育时期种子(开花后10、20、30、40 d)中的组织表达特性;通过双酶切将紫苏Pfgpat9基因完整的ORF序列连接到酵母表达载体pYES2.0上,将重组质粒转化至野生型酵母菌株INVSc1和缺陷型酵母gat1,并验证该基因的功能。结果显示:紫苏Pfgpat9基因ORF为1 116 bp,共编码371个氨基酸,理论等电点pI为8.96,不稳定系数为46.67,亲水性系数为-0.108,是一种亲水性不稳定蛋白。紫苏Pfgpat9基因具有典型的GPAT9功能结构域,包含3个典型的跨膜螺旋区;多序列比对分析表明,紫苏PfGPAT9蛋白与油橄榄、茶树和向日葵GPAT9蛋白的亲缘关系较近;qRT-PCR分析显示,Pfgpat9基因在紫苏不同组织中均表达,在种子发育不同时期表达量呈先升高后降低趋势,在开花后20 d表达量达到最高;酵母转化结果表明,转Pfgpat9基因野生型酵母和转Pfgpat9基因缺陷型酵母总脂含量均提高,且C16∶0、C16∶1含量均有所提高。研究表明,Pfgpat9基因在紫苏种子油脂合成积累过程中发挥重要作用,这为进一步通过基因工程及转基因技术改良紫苏品质提供了新的方向。     

烟草二脂酰甘油酰基转移酶基因(NtDGAT2)的克隆与功能分析

二脂酰甘油酰基转移酶(diacylglycerol acyltransferase,DGAT2)是植物储存油脂生物合成过程中的关键酶,对种子储存油脂累积具有重要的生理作用。本文采用电子克隆与实验相结合的方法,从烟草种子cDNA中克隆到DGAT2基因的开放阅读框序列,命名为NtDGAT2(GenBank登录号JX843807),其序列长999bp,编码332个氨基酸。多序列比对和进化分析表明该基因编码蛋白与其他植物DGAT2具有较高相似性和典型的DGAT2结构域。利用Real-time PCR定量表达分析显示Nt-DGAT2在烟草种子、花、茎、叶和根里面都有表达,且在发育中的种子和花的发育过程大量表达。酵母互补实验证实该基因编码蛋白具有DGAT酶活性。     

番茄醇酰基转移酶基因SlAAT1克隆、序列分析和原核表达

酯类物质是许多果实香气的主要成分。醇酰基转移酶(AATs)是酯类化合物合成的关键酶。本研究通过反转录PCR,从番茄的成熟果实中克隆了SlAAT1基因(GenBank登录号为JQ070977),其编码一个含有442个氨基酸残基的蛋白,含有醇酰转移酶BAHD家族的H-x-x-x-D和DFGWG保守基序。系统进化分析表明,SlAAT1与苹果MpAAT1,山字草的BEBT及烟草Hsr201等聚在同一分支,进化关系较近。SDS-PAGE电泳分析表明,转化SlAAT1基因的大肠杆菌BL21(DE3)在22℃、0.8 mmol·L^-1 IPTG条件下可获得大量的可溶性目标蛋白。同时,纯化的SlAAT1大肠杆菌重组蛋白的体外酶活性分析表明了SlAAT1重组蛋白具有醇酰基转移酶活性,可能参与了酯类挥发性成分的合成。     

紫苏PfLEC1基因的克隆及表达研究

紫苏是目前发现的α-亚麻酸含量最高的药食同源经济作物,其种子油脂中含60%以上的α-亚麻酸。该研究基于紫苏转录组测序结果,从紫苏种子中克隆获得植物种胚发生过程中的关键基因Leafy Cotyledon 1(Pf LEC1),并对其进行相关生物信息学分析、实时荧光定量PCR以及不同时期种子的脂肪酸含量测定,以探讨紫苏α-亚麻酸高效合成积累的分子调控机制。(1)序列分析结果表明,Pf LEC1基因编码区长度为621 bp,可编码206个氨基酸,属于NF-YB亚基家族,含有HAP3亚基的保守功能域B区域;在线预测该蛋白为不稳定亲水性蛋白,无信号肽和跨膜区域,定位于细胞质;进化分析表明,该蛋白序列与拟南芥、甘蓝型油菜、水稻和玉米关系较近。(2)实时荧光定量PCR分析表明,PfLEC1基因在紫苏根、茎、叶、花及种子中均有表达,且在种子中表达量最高,根中表达最低;PfLEC1在种子发育的前期表达较高,随着种子发育表达量显著下降。(3)不同阶段紫苏种子脂肪酸含量分析表明,油酸、α-亚麻酸含量随种子发育逐渐增加,而棕榈酸、硬脂酸、亚油酸含量变化则相反,其中变化最为明显的是α-亚麻酸,从种子发育5 d时的33.16%上升至20 d时的65.16%,表明紫苏种子中α-亚麻酸含量是随种子发育快速积累的。研究推测,PfLEC1可能与紫苏种子α-亚麻酸的高含量合成积累密切相关,该研究为今后深入探讨PfLEC1基因的功能奠定了分子基础。     

自分泌运动因子-溶血磷脂酸轴的生物学功能与调控

自分泌运动因子(autotaxin,ATX)也称作磷酸二酯酶Iα,是核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族(nucleotide pyrophosphatases,NPPs)中的一员,因而也称作NPP2.ATX是NPPs中唯一具有溶血磷脂酶D(lysophospholipase D,lysoPLD)活性的成员,它可以将溶血磷脂...     

黑子南瓜甘油-3-磷酸酰基转移酶基因的克隆及序列分析

依据国外报道的南瓜甘油－３－磷酸转酰酶（ＧＰＡＴ）基因的ｃＤＮＡ序列合成相应引物,用ＲＴ－ＰＣＲ技术,成功地分离了黑子南瓜（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｆｉｃｉｆｏｌｉａ）ＧＰＡＴ基因的ｃＤＮＡ片段,并亚克隆到了ｐＧＥＭ－Ｔ载体系统的多克隆位点上,序列分析表明黑子南瓜ＧＰＡＴ基因的ｃＤＮＡ序列及递推的氨基酸序列与南瓜（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｍｏｓｃｈａｔａ）相比分别具有９８％和９６５％的同源性。在１１８８ｂｐ中有２２个核苷酸发生变化,导致１３个氨基酸的改变     

4″-异戊酰基转移酶基因重组质粒构建及其异源表达

目的:通过构建重组质粒,异源表达4＂-异戊酰基转移酶基因(4＂-isovaleyltrasferase gene,ist)生产螺旋霉素.方法:在螺旋霉素的4＂位加上异戊酰基侧链从而获得基因药物必特螺旋霉素基因.结果:研究表明acyB2基因是ist的正调控基因,ist基因与acyB2基因构建的ist-acyB2共表达质粒不能在变铅青链霉菌TK24中表达.启动区点突变的回复表明770bp到780bp之间有一碱基由原来的A回复成G.结论:经测序研究后发现在ist的启动区产生了一个点突变,拟回复此突变之后重新构建新的ist-acyB2载体,可用于检测ist基因在异源宿主中的表达情况.     

地黄氧-酰基转移酶WSD基因的鉴定与表达分析

植物蜡酯合成酶催化长链醇和长链脂肪酸合成蜡酯,对植物蜡质合成及其抗旱、抗致病菌袭击和紫外辐射、抗寒和昆虫侵害等环境胁迫具有非常重要的作用;镉是环境中含量最高的有毒重金属之一,严重威胁植物的生长发育、质量、产量和食用安全。为研究地黄蜡酯合成酶基因镉胁迫表达,该文从地黄全长转录组测序数据中鉴定其成员,并用生物信息学技术与qRT-PCR对其编码蛋白质的理化性质、系统进化和保守结构域及其组织表达与镉胁迫表达进行分析。结果表明：(1)鉴定出两个蜡酯合成酶基因RgOATWSD1与RgOATWSD2,其编码蛋白质的长度、理论等电点和相对分子量依次为463 aa与473 aa、8.86与9.34、51.31 kD与52.49 kD,均为不稳定蛋白。(2)二者均具有acyl＿WS＿DGAT保守域与DUF1298超家族,前者占其氨基酸序列的92.65%～94.50%。(3)二者均定位于内质网中,二级结构以无规卷曲与α螺旋为主;RgOATWSD1为跨膜蛋白,而RgOATWSD2不是。(4)二者均在地黄根、茎、叶中差异表达。(5)二者表达均受镉胁迫诱导,但其表达变化趋势不同。该研究鉴定了两个镉胁迫应答反应的蜡酯合成酶基因,为地黄RgOATWSD的镉胁迫表达及功能研究奠定了基础。     

致病性猪链球菌2型溶血素基因的克隆与表达

目的：克隆溶血素基因,为评价溶血素的毒力与抗原活性,构建猪链球菌疫苗提供依据。方法：从致病性猪链球菌II型四川资阳分离株基因组中分离溶血素基因,经中间T载体,将其克隆至改造的pGEX-6p1中,最后通过蛋白质电泳和溶血实验检验溶血素的表达及活性。结果：SDS-PAGE结果表明,重组溶血素在5h表达水平最高,10h次之,15h最弱;溶血实验重组菌周围形成明显的透明溶血环。结论：溶血素为分泌性早期表达,具有正常的β溶血活性。     

大豆酪氨酸氨基转移酶基因的克隆与表达分析

采用电子克隆与实验克隆相结合的方法获得了大豆酪氨酸氨基转移酶基因的cDNA序列,GenBank登录号为DQ003328.序列分析结果表明,该cDNA序列含有一个编码425个氨基酸的完整的开放读码框,5′非翻译区具有多个同框终止密码子,3′端具有3个加尾信号和polyA尾巴.启动子区除含有通用核心元件外,还含有许多与光反应有关的作用元件.氨基酸序列比对和系统发育分析结果显示,不同物种之间酪氨酸氨基转移酶的氨基酸序列同源性较高.电子表达分析和RT-PCR组织表达分析结果表明,该基因的表达量与组织中叶绿体含量具有很高的关联,强光逆境能够上调该基因的表达.     

紫苏油脂合成相关基因家族鉴定及表达分析

该研究从转录组数据库中筛选鉴定紫苏溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAT)家族基因,采用生物信息学方法分析了该家族基因的序列特征及蛋白结构,利用qRT-PCR技术对该基因时空表达特性进行了研究,为进一步了解紫苏油脂合成机制提供理论依据。结果表明:(1)从紫苏转录组数据库中共检测出11个LPAT家族基因,分别命名为PfLPAT1、PfLPAT2-1、PfLPAT2-2、PfLPAT2-3、PfLPAT2-4、PfLPAT4-1、PfLPAT4-2、PfLPAT5-1、PfLPAT5-2、PfLPAT5-3和PfLPAT5-4;PfLPATs编码氨基酸长度介于250～384 aa之间,理论等电点在7.6～9.6之间。(2)基因序列比对结果表明,11个PfLPATs蛋白分别属于3个亚类,其中1型LPAT包含1个基因,2/3型LPAT包含4个,4/5型LPAT包含6个。(3)实时荧光定量PCR结果显示,11个LPAT家族基因在‘晋紫苏1号’不同组织中均有表达,其中LPAT2-1、LPAT2-2和LPAT2-3在种子中表达量较高,推测其在紫苏种子油脂合成代谢过程中发挥重要作用。该结果为后续紫苏LPAT家族基因的功能研究提供了重要的基因信息。     

The stress- and abscisic acid-induced barley gene HVA22: developmental regulation and homologues in diverse organisms

Abscisic acid (ABA) induces the expression of a battery of genes in mediating plant responses to environmental stresses. Here we report one of the early ABA-inducible genes in barley (Hordeum vulgare L.), HVA22, which shares little homology with other ABA-responsive genes such as LEA (late embryogenesis-abundant) and RAB (responsive to ABA) genes. In grains, the expression of HVA22 gene appears to be correlated with the dormancy status. The level of HVA22 mRNA increases during grain development, and declines to an undetectable level within 12 h after imbibition of non-dormant grains. In contrast, the HVA22 mRNA level remains high in dormant grains even after five days of imbibition. Treatment of dormant grains with gibberellin (GA) effectively breaks dormancy with a concomitant decline of the level of HVA22 mRNA. The expression of HVA22 appears to be tissue-specific with the level of its mRNA readily detectable in aleurone layers and embryos, yet undetectable in the starchy endosperm. The expression of HVA22 in vegetative tissues can be induced by ABA and environmental stresses, such as cold and drought. Apparent homologues of this barley gene are found in phylogenetically divergent eukaryotic organisms, including cereals, Arabidopsis, Caenorhabitis elegans, man, mouse and yeast, but not in any prokaryotes. Interestingly, similar to barley HVA22, the yeast homologue is also stress-inducible. These observations suggest that the HVA22 and its homologues encode a highly conserved stress-inducible protein which may play an important role in protecting cells from damage under stress conditions in many eukaryotic organisms.     

紫苏硬脂酰 ACP 脱氢酶基因家族鉴定及表达分析

硬脂酰-ACP脱氢酶(SAD)催化硬脂酸脱氢生成油酸,是形成不饱和脂肪酸的关键酶。该研究从紫苏转录组数据库中筛选鉴定紫苏硬脂酰-ACP脱氢酶(PfSAD)家族基因,并进行生物信息学分析及保守功能域分析,用qRT-PCR技术检测PfSADs各成员在不同组织中的表达特性,以探讨PfSAD家族基因在调控种子脂肪酸组分中的作用,为紫苏脂肪酸组分的遗传改良提供基因元件。结果显示:(1)从该课题组前期自测的紫苏转录组数据库中共检测出6个PfSAD家族基因,其编码蛋白的氨基酸长度介于367~396 aa之间,均具有SAD的保守结构域和二铁中心,预测其基因编码蛋白均定位于叶绿体。(2)多序列比对结果显示,紫苏PfSADs蛋白序列与拟南芥、蓖麻及可可等植物的SAD蛋白序列相似性均在50%以上;系统进化分析显示,6个紫苏SAD蛋白被分为3个亚组,其中第一个亚组包含PfSAD1,第二亚组包含PfSAD2、PfSAD3,第三亚组包含PfSAD4、PfSAD5和PfSAD6。(3)实时荧光定量PCR分析发现,PfSADs各成员在‘晋紫苏1号’不同组织中的表达量差异显著,其中PfSAD1主要在叶中表达,PfSAD2、PfSAD3、PfSAD4和PfSAD5在种子中表达量较高,PfSAD6在花中具有显著表达优势。研究表明,PfSADs具有典型的保守基序及催化SAD的活性中心,其各成员在不同的组织中高表达,推测这6个基因均参与了硬脂酰ACP(C18∶0-ACP)脱氢生成油酰基ACP(Δ9C18∶1-ACP)的过程,在紫苏油脂合成代谢过程中发挥重要作用。     

牡丹DGAT基因的克隆及表达分析

利用RT-PCR和RACE技术,从牡丹种子中克隆得到1个二酰甘油酰基转移酶基因(DGAT),命名为PaDGAT1(GenBank登录号为MG214258)。PaDGAT1基因cDNA全长为2 028bp,包含1 554bp开放阅读框,编码517个氨基酸。PaDGAT1蛋白属于疏水性碱性蛋白,分子量为58.86kD,理论等电点为8.62,二级结构预测表明,无规则卷曲和延伸链是该蛋白的主要结构元件。氨基酸序列对比分析表明,PaDGAT1基因编码的蛋白属于DGAT1亚家族,与油橄榄(Olea europaea)的DGAT1蛋白亲缘关系最近。实时荧光定量分析结果表明,PaDGAT1基因在花芽中表达水平较高,在叶、茎和未发育子房中表达水平较低;在种子发育过程中,PaDGAT1基因表达水平呈现出升高-降低-升高的趋势,其中在发育28d时表达水平最高,随后其表达水平逐渐减低,在种子发育70d时又升高,至发育末期的85d时表达水平升高至较高水平;在种子收获后,常温存放7d时,PaDGAT1基因表达水平最高,随后其表达水平逐渐下降。结果推测,DGAT基因在牡丹种子的油脂合成中起重要的调控作用。     

水稻超短根突变体ssr1的遗传分析和基因定位

该研究从甲基磺酸乙酯(EMS)诱变的籼稻‘Kasalath’突变体库中筛选到1个根系超短的突变体,命名为ssr1(super short root 1),8d苗龄突变体的主根和不定根长度分别只有野生型的8.89%和2.29%,其不定根发生正常,但侧根的发生和伸长都受到严重抑制,且根毛也非常短。此外,ssr1植株整体矮小,株高不到野生型的一半。遗传分析结果表明,该突变性状由1对隐性核基因控制。利用图位克隆技术将SSR1基因定位在第9染色体的STS(sequence tagged site)分子标记9g7047K和9g7290K之间,物理距离约为243kb,在定位区间共发现39个预测基因,经分析其中没有已克隆的根系发育基因。对SSR1的定位为进一步克隆该基因和阐明水稻根构型的分子机理奠定了基础。     

A dehydrin cognate protein from pea (Pisum sativum L.) with an atypical pattern of expression

Dehydrins are a family of proteins characterised by conserved amino acid motifs, and induced in plants by dehydration or treatment with ABA. An antiserum was raised against a synthetic oligopeptide based on the most highly conserved dehydrin amino acid motif, the lysine-rich block (core sequence KIKEK-LPG). This antiserum detected a novel M_r 40 000 polypeptide and enabled isolation of a corresponding cDNA clone, pPsB61 (B61). The deduced amino acid sequence contained two lysine-rich blocks, however the remainder of the sequence differed markedly from other pea dehydrins. Surprisingly, the sequence contained a stretch of serine residues, a characteristic common to dehydrins from many plant species but which is missing in pea dehydrin.The expression patterns of B61 mRNA and polypeptide were distinctively different from those of the pea dehydrins during seed development, germination and in young seedlings exposed to dehydration stress or treated with ABA. In particular, dehydration stress led to slightly reduced levels of B61 RNA, and ABA application to young seedlings had no marked effect on its abundance.The M_r 40 000 polypeptide is thus related to pea dehydrin by the presence of the most highly conserved amino acid sequence motifs, but lacks the characteristic expression pattern of dehydrin. By analogy with heat shock cognate proteins we refer to this protein as a dehydrin cognate.     

Mn-SOD基因导入黄瓜的遗传转化体系

黄瓜是我国栽培面积最大的喜温蔬菜之一。在生产上,高温干旱等环境胁、迫因子严重危害黄瓜的产量和品质,甚至导致绝收。任安芝等综述了SOD与水分、盐分、低温和大气污染等逆境胁迫之间的关系,认为:各种逆境胁迫引起的活性氧代谢平衡失调、生物膜结构破坏是导致植物遭受逆境伤害的机理之一。通过基因工程提高植物体内抗氧化酶活性及增加抗氧化代谢的水平是增强植物抗逆性的有效     

水稻粒长QTL定位与主效基因的遗传分析

该研究利用短粒普通野生稻矮杆突变体和长粒栽培稻品种KJ01组配杂交组合F_1,构建分离群体F_2;并对该群体粒长进行性状遗传分析,利用平均分布于水稻的12条染色体上的132对多态分子标记对该群体进行QTL定位及主效QTLs遗传分析,为进一步克隆新的主效粒长基因奠定基础,并为水稻粒形育种提供理论依据。结果表明:(1)所构建的水稻杂交组合分离群体F_2的粒长性状为多基因控制的数量性状。(2)对543株F_2分离群体进行QTL连锁分析,构建了控制水稻粒长的连锁遗传图谱,总长为1 713.94 cM,共检测出24个QTLs,只有3个表现为加性遗传效应,其余位点均表现为遗传负效应。(3)检测到的3个主效QTLs分别位于3号染色体的分子标记PSM379～RID24455、RID24455～RM15689和RM571～RM16238之间,且三者对表型的贡献率分别为54.85%、31.02%和7.62%。(4)在标记PSM379～RID24455之间已克隆到的粒长基因为该研究新发现的主效QTL位点。     

Jasmonic acid-inducible gene expression of a Kunitz-type proteinase inhibitor in potato tuber disks

Messenger RNAs of a potato (Solanum tuberosum L.) Kunitz-type proteinase inhibitor(s) (PKPI) were present in potato disks excised from tubers stored for 14 months (old tubers) or 2 months (young tubers) after harvest, and disappeared during the aseptic culture. The PKPI mRNA accumulation was found to be induced in potato disks from the old tubers by the addition of jasmonic acid (JA) [3-oxo-2-(2-cis-pentenyl)-cyclopentane-1-acetic acid].