多枝赖草基因组可转化人工染色体（TAC）文库的构建和鉴定

为了克隆和转化多枝赖草（Leymus multicaulis）耐黄矮病、耐蚜虫、耐干旱、耐盐碱等抗逆性基因,利用脉冲电泳分离纯化2Mb以上核DNA,酶切后回收10～200kbDNA片段按大小分5组与TAC载体连接后电转化导入细菌DH10B,在卡那霉素和蔗糖选择压下均有阳性克隆．用两种TAC载体pYLTAC17和pYLTAC747H／sacB分别构建了文库I和II,约16．5和23．6万个克隆,估计覆盖3～5倍多枝赖草基因组大小．文库以混合克隆形式保存在12×2块深孔96孔板中,每孔1．2mL菌液中含300～600个克隆,40多万个克隆转存到3块384孔板,留24个孔存叶绿体和线粒体DNA探针菌液,可用于后续文库鉴定．此外,从文库I和II分别挑取2501和2890个单克隆存于14块384孔板中．17块384孔板都用GeneTAC^TMG3复制了2份,点高密度杂交膜6张,以多枝赖草谷胱甘肽还原酶基因5＇RACE,GR和3＇RACE＋GR为探针初步筛选到19个阳性克隆,两文库为多枝赖草抗性基因的克隆、物理图谱的构建、功能验证等基因组有关研究奠定了基础。