抗VEGF单克隆抗体Fab片段在E.coli中的分泌表达

目的：在大肠杆菌中构建、表达和纯化抗血管内皮生长因子（VEGF）的Fab片段（兰尼单抗,ranibizumab）,通过发酵条件的控制实现其在大肠杆菌周质和胞外的高效分泌表达,并检测其抗VEGF的活性。方法：以pET30a为质粒载体,构建了Fd链和L链前都含有OmpA信号肽、SD序列和T7 promoter的克隆载体pET30a（+）-LC-HC,转化BL21（DE3）表达菌株,并进行了培养基、温度和IPTG诱导浓度的条件优化。结果：确定Fab片段在大肠杆菌分泌表达摇瓶发酵最佳条件为：在含有1.5% Tryptone,1% Yeast Extract,0.5% Glucose,0.15% NaCl,0.1% NH₄Cl,0.08% MgCl₂·6H₂O的1L培养基的摇瓶中,按照10%的接种量,37℃摇床培养至对数生长后期（OD₆₀₀为2左右）,添加0.1mmol/L IPTG诱导剂,于16℃条件下诱导表达过夜（16h左右）。用周质破菌提取分泌至大肠杆菌周质腔的Fab片段,同时用中空纤维柱浓缩发酵培养基,最后用ProteinG亲和层析柱一步纯化洗脱,经SDS-PAGE检测分析和Brandford法测蛋白浓度得出纯化的Fab抗体片段纯度在90%以上,分泌表达纯化量为0.4mg/L。以VEGF165作为结合抗原,间接ELISA分析纯化后的Fab抗体EC50=30ng/ml。继续用该培养基在3.7L体积发酵罐中进行2L体积的发酵,获得最终的菌体产率为30g/L,可亲和纯化Fab抗体量为1.94mg/L。结论：成功实现了Fab抗体片段在大肠杆菌中的高效分泌表达,且具有很高的活性,为规模化制备Fab抗体片段提供了研究依据。