基于转录组的苹小卷叶蛾杀虫剂靶标及解毒代谢相关基因分析

【目的】建立苹小卷叶蛾Adoxophyes orana转录组数据库,挖掘杀虫剂靶标及解毒代谢相关基因。【方法】采用Illumina HiSeq~(TM) 2000高通量测序技术对苹小卷叶蛾进行转录组测序,挖掘并分析杀虫剂靶标基因;利用qPCR检测6个杀虫剂靶标基因在苹小卷叶蛾卵、幼虫、蛹和成虫各不同发育阶段的表达;挖掘并分析苹小卷叶蛾转录组中解毒代谢相关基因的代谢通路及进化关系。【结果】通过组装有效序列共获得48 610条unigene(GenBank登录号:GGMW00000000)。挖掘鉴定到155个杀虫剂靶标unigene;qPCR结果显示,1个蜕皮激素受体(ecdysone receptor, ECR)、2个乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase, AChE)、1个氯离子通道蛋白(chloride channel, CLC)、1个几丁质酶(chitinase, CS)和1个鱼尼丁受体(ryanodine receptor, RyR)基因在苹小卷叶蛾不同发育阶段均存在表达差异。挖掘鉴定到69个羧酸酯酶(carboxylesterase, CarE)unigene、66个谷胱甘肽S-转移酶(glutathion S-transferase, GST)unigene和205个细胞色素P450(cytochrome P450)unigene等解毒代谢相关基因,共鉴定20个CarE unigene, 32个GST unigene和30个P450 unigene与有毒物质代谢相关的通路有关。基于氨基酸序列对具有完整ORF的unigene聚类分析结果显示:12个CarEs中9个为G类,即鳞翅目保幼激素类;分别有10个AoGSTs属于Delta和Epsilon亚家族;18个P450全部聚到CYP3集团。【结论】该研究有助于苹小卷叶蛾杀虫剂靶标基因的挖掘及抗药性的研究。     

桃小食心虫CsasCSP14的基因克隆及分子对接

[目的]本研究旨在获得桃小食心虫Carposina sasakii Matsumura CsatsCSP14基因序列,分析其在雌雄不同组织中的表达差异,并与寄主挥发物进行分子对接,为该基因的功能研究提供参考.[方法]以桃小食心虫全组织cDNA为模板,通过PCR技术扩增克隆获得CsasCSP14 cDNA序列全长;利用生信分析软件分析其编码蛋白的理化性质和结构特征;通过荧光定量PCR技术分析CsasCSP14在桃小食心虫雌雄成虫不同组织(触角、头、胸、腹、足和翅)中的表达情况;使用Modeller(version 9.19)构建CsasCSP14蛋白的三维结构模型;运用Autodock 4.2将CsasCSP14与32种苹果挥发物和2种性信息素分子进行分子对接.[结果]克隆获得了桃小食心虫化学感受蛋白基因CsasCSP14的cDNA序列,其开放阅读框(Open reading frame,ORF)长度为369 bp,编码122个氨基酸,预测其蛋白分子量为14.13 ku,理论等电点为5.20,有17个氨基酸残基组成的信号肽序列,且18-122位氨基酸之间存在昆虫化学感受蛋白家族保守结构域;含有4个保守的半胱氨酸位点.CsasCSP14具有6个α螺旋;氨基酸同源比对结果显示,CsasCSP14与玉米螟Pyraustanubilalis OfurCSP5的氨基酸序列一致性最高,达到79.01％.荧光定量PCR结果显示,CsasCSP14在雌雄成虫的触角、头、胸、腹、足和翅中均有表达,但是其表达丰度有差异,在雌雄成虫触角中的表达量最高.通过Modeller软件搜索CsasCSP14三维结构的模板,得到与沙漠蝗Schistocerca gregaria CSPsg4序列相似性为65.7％.因此以CSPsg4为模板成功构建CsasCSP14三维结构.分子对接结果表明CsasCSP14与2-己烯醛、桃醛、醋酸丁酯、庚醛、异戊醛和法尼烯气味分子结合能比较低,并且Leu-22、Phe-29、Phe-42和Ile-46 4个疏水性氨基酸残基在结合过程中发挥了关键作用.[结论]本研究为进一步了解桃小食心虫CsasCSP14基因功能和利用化学生态的方法防控该虫提供了前期理论基础.