利用6-磷酸-β-葡萄糖苷酶在低温条件下获得酶-底物复合物实际结构的方法

利用“酶晶体低温抑活底物固定”方法,在?20 ℃条件下,将6-磷酸-β-葡萄糖苷酶 (BglA) 晶体与底物对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷-6-磷酸 (pNPβG6P) 进行浸泡试验,通过X射线进行衍射数据收集并处理,获得了完整的底物电子密度图。研究结果表明,在不突变酶中关键基团使酶失活,以及不选用底物类似物替代原有底物的情况下,通过上述方法,可以获得酶与底物复合物的实际结构。该研究结果可为今后低温酶学及复合物中间态的进一步研究提供帮助。     

可溶性人类白细胞抗原F和分化簇8α同二聚体的表达、纯化与相互作用

为了获得大量可溶性人类白细胞抗原F (Human leukocyte antigen F,HLA-F) 和分化簇8α同二聚体 (Cluster of differentiation 8α homodimers,CD8αα) 蛋白并对它们的相互关系进行研究,通过同义突变的方法改变了HLA-F和CD8αα基因序列N端的大肠杆菌稀有密码子,获得了高效表达的HLA-F和CD8αα包涵体蛋白;所表达的蛋白通过稀释法复性后,分别进行了凝胶过滤层析和离子交换纯化。经凝胶过滤层析和native-PAGE检测,推测HLA-     

大肠杆菌重组乳链菌肽抗性蛋白(NSR)的表达纯化及其功能分析

乳链菌肽(Nisin)是由某些乳酸菌产生的一种阳离子抗菌肽, 而Nisin抗性蛋白(Nisin resistance protein, NSR)的表达则使一些非 Nisin产生菌获得Nisin抗性。为深入探索NSR的作用机制, 本研究在大肠杆菌中表达了去除N末端38个氨基酸残基的NSR(NSRΔ38)与GST的融合蛋白GST-NSRΔ38。通过谷胱甘肽(GSH)亲和层析和GST标签的切除后, 得到纯化的NSRΔ38, 并测定了该蛋白可能的nisin降解活性。反应产物的抑菌活性测定结果表明被NSRΔ38作用     

P450cam突变体蛋白表达、纯化与结晶的改进及其四突变体（F87L/Y96F/L244A/V247A）晶体结构

在P450cam突变体蛋白纯化过程中使用280 nm/392 nm双波长比值检测蛋白质纯度, 采用β-巯基乙醇对蛋白质进行还原性保护,有效地缩短了纯化进程,纯化效率相应提高.以PEG 8000为沉淀剂经悬滴汽相扩散法筛选得到适合衍射的P450cam四突变体（F87L/Y96F/L244A/V247A）晶体,在Mar-Research面探测器系统上收集了0.22 nm分辨率的X射线衍射数据.采用同晶差值傅立叶法解析结构,最后的晶体学R因子和R_free分别为0.197和0.247,键长偏差为0.001 77 nm,键角偏差为1.96°.结构测定显示P450cam四突变体（F87L/Y96F/L244A/V247A）和P450cam野生型的整体构象无重大变化,突变后活性口袋变大而疏水性增加,这与突变设计预期目标一致.     

腾冲嗜热厌氧杆菌6-磷酸-β-葡萄糖苷酶的表达与结晶及其功能鉴定

6-磷酸-β-葡萄糖苷酶 (PbgL,EC 3.2.1.86) 催化由磷酸烯醇式丙酮酸 糖磷酸转移酶系统(PEP-PTS)转运入胞内的某些磷酸化二糖水解．一段来自腾冲嗜热厌氧杆菌 (Thermoanaerobacter tengcongensis) 编码PbgL (436个氨基酸残基) 的开放阅读框 (ORF TTE0337)被成功克隆,并在大肠杆菌BL21(Escherichia coliBL21)中有活性地表达．序列分析显示,该6-磷酸-β-葡萄糖苷酶属于糖基水解酶家族4(GH4),与枯草杆菌(Bacillus subtilis)的LicH,海栖热袍菌(Thermotoga Maritima)的BglT的一致性分别为62%和40%．纯化后的重组PbgL(rPbgL)经SDS-PAGE分析,为1条分子量约50 kD的蛋白条带,与推测的分子量大小一致．该酶需要Mn²⁺、NAD⁺ 和 还原剂为辅因子,能专一性地水解pNPβG6P,并在85 ℃达到最高酶活性．Western免疫印迹实验,利用针对rPbgL的多克隆抗体血清,能从腾冲嗜热厌氧杆菌胞内检测到PbgL的表达．此外,rPbgL的蛋白晶体已被筛选获得,并收集到2.4Å分辨率的衍射数据．采用分子置换法的结构解析目前仍在进行中．