基于PCR的质粒快速定点诱变方法建立与评价

基因突变对生命的进化具有重要意义,针对质粒的DNA定点诱变技术也是基因工程、蛋白质工程研究中的重要手段之一。为了提高质粒定点诱变的效率,本研究利用引物部分重叠的设计方案,使用Tm值相对固定的引物设计模式,将同一引物分为重叠区（Tm=50±2℃）和非重叠区（Tm=60±2℃）,并在严格控制模板用量（2 pg/kb）的基础上,通过20个PCR循环对目标质粒进行定点诱变扩增,随后取0.5 μL产物直接用于转化。在FastPfu Fly酶系中,利用此法构建了6个含碱基替换、缺失和插入的质粒,均获得成功,突变效率可达96%以上,阳性克隆获得数达70个以上。此外,利用4种不同PCR酶系对该法的适用性进行了评价,结果表明突变效率均可达93%以上,阳性克隆获得数均在10个以上。通过适当增加PCR模板用量（10 pg/kb）并使用纯化后的PCR产物进行转化,该法可适用于转化效率大于106（cfu/μg）的任意感受态细胞,对应的突变效率可大于91%,阳性克隆获得数大于20。根据本法的作用原理,该方案适合质粒中10～20 bp（因重叠区GC含量及碱基序列的不同而改变）以内的任意碱基替换和插入,以及任意长度的DNA片段缺失。且具有通用性强、耗时少、诱变成功率高、成本低、对感受态及转化效率无特殊要求等优点,适合各实验室的日常研究使用。