一株新的重组蛙病毒△67R-RGV的构建及基因67R的初步功能鉴定

沼泽绿牛蛙病毒(Rana grylio virus,RGV)属于虹彩病毒科(Iridoviridae),蛙病毒属(Ranavirus),其基因组中含编码尿嘧啶脱氧核糖核苷三磷酸酶(dUTPase)的基因67R。通过构建缺失67R的重组病毒Δ67R-RGV,探讨67R在RGV复制和感染过程中的功能。首先构建携带有作为标记的绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescence protein,EGFP)基因的质粒(pGL3-67RL-p50-EGFP-67RR),然后将该质粒与RGV基因组在67R位点进行同源重组(homologous recombination),并接种到培养的鲤鱼上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum cyprinid,EPC)单层细胞中。利用荧光显微观察,判断并筛选有感染性的重组病毒(Δ67R-RGV)。经过十轮挑斑分离,直至在普通显微镜下观察到的细胞病变空斑与荧光显微镜观察到的绿色荧光空斑完全吻合,获得一株新的、纯化的重组蛙病毒Δ67R-RGV。再以野生型蛙病毒(wt-RGV)为对照,分别扩增并提取wt-RGV和Δ67R-RGV的基因组DNA,进行PCR检测。结果显示,在wt-RGV基因组中可检测到67R;但在Δ67R-RGV基因组中仅检测到EGFP,却检测不到67R,证实在构建重组病毒时,EGFP的确按预期插入67R位点。进一步分别测定了wt-RGV与Δ67R-RGV的一步生长曲线,结果无显著差别,表明67R及其编码产物dUTPase的缺失并不影响RGV的正常复制,67R为病毒非必需基因。     

我国转基因鱼研制的历史回顾与展望

中国自从诞生了首例转基因鱼以来,在后续30多年里取得了一系列重要研究进展。全球范围的转基因鱼研究包括多种养殖鱼类,目标性状涉及快速生长、抗病抗逆和品质改良。现在已经初步建成转基因鱼育种技术体系和安全评估体系,为转基因鱼产业化奠定了重要基础。本文以转基因黄河鲤育种研究为主线,简要回顾了转基因鱼研究的发展历程,并对转基因鱼育种面临的问题和发展前景进行了分析和展望。     

蛙虹彩病毒一个序列保守基因(RGV-12L)的克隆表达及定位分析

从蛙虹彩病毒(Rana grylio virus,RGV)中克隆出一个虹彩病毒科的序列保守基因RGV-12L, 序列分析表明该基因全长894 bp, 编码一个含297个氨基酸的多肽,分子量为33 kD。构建包含该基因全长的原核表达载体, 进行原核表达,获得了分子量约53 kD的融合蛋白。将融合蛋白经腹腔注射免疫小鼠,制备出鼠抗RGV-12L血清。通过RT-PCR和Western blotting分析RGV感染细胞后RGV-12L的转录时序, 感染4h可以在RNA水平检测到RGV-12L的转录, 感染8h可以在蛋白水平检测到RGV-12L的表达。用DNA复制抑制剂阿糖胞苷(Arac)进行药物抑制实验,鉴定出RGV-12L是一个晚期基因。免疫荧光分析显示RGV-12L分布于感染细胞的细胞核和细胞质中, 在病毒加工厂中也有该蛋白的分布, 提示该基因可能与病毒的装配、释放有关。       

一株新的重组蛙病毒Δ67R-RGV的构建及基因67R的初步功能鉴定北大核心CSCD

沼泽绿牛蛙病毒(Rana grylio virus,RGV)属于虹彩病毒科(Iridoviridae),蛙病毒属(Ranavirus),其基因组中含编码尿嘧啶脱氧核糖核苷三磷酸酶(dUTPase)的基因67R。通过构建缺失67R的重组病毒Δ67R-RGV,探讨67R在RGV复制和感染过程中的功能。首先构建携带有作为标记的绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescence protein,EGFP)基因的质粒(pGL3-67RL-p50-EGFP-67RR),然后将该质粒与RGV基因组在67R位点进行同源重组(homologous recombination),并接种到培养的鲤鱼上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum cyprinid,EPC)单层细胞中。利用荧光显微观察,判断并筛选有感染性的重组病毒(Δ67R-RGV)。经过十轮挑斑分离,直至在普通显微镜下观察到的细胞病变空斑与荧光显微镜观察到的绿色荧光空斑完全吻合,获得一株新的、纯化的重组蛙病毒Δ67R-RGV。再以野生型蛙病毒(wt-RGV)为对照,分别扩增并提取wt-RGV和Δ67R-RGV的基因组DNA,进行PCR检测。结果显示,在wt-RGV基因组中可检测到67R;但在Δ67R-RGV基因组中仅检测到EGFP,却检测不到67R,证实在构建重组病毒时,EGFP的确按预期插入67R位点。进一步分别测定了wt-RGV与Δ67R-RGV的一步生长曲线,结果无显著差别,表明67R及其编码产物dUTPase的缺失并不影响RGV的正常复制,67R为病毒非必需基因。     

一种新型草鱼呼肠孤病毒人工感染方法

研究从患病草鱼中新分离到一株草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus,GCRV）,对其进行了病毒纯化与电镜观察、基因组RT-PCR分型以及病毒量定量分析等,并在此基础上探索了一种新的病毒人工感染方法。取病鱼肌肉组织进行病毒纯化与电镜观察,观察到大量病毒粒子,直径在70-80 nm。病毒基因组RT-PCR扩增结果表明,该草鱼呼肠孤病毒新分离株属基因型Ⅱ型GCRV;通过绝对定量的方法,对病毒悬液的浓度进行了测定,为2.97×103 copy/μL。通过灌胃法,对3个组别的实验鱼分别感染不同浓度的病毒液,同时设置灌胃PBS的组别作为对照组。结果显示,3个实验组死亡率均在80%左右,而对照组仅出现一例死亡个体。实验组死亡个体体表发黑,腹部、鳍条基部以及鳃盖处均有明显的出血症状,为草鱼出血病的典型症状。随机选取死亡的个体进行RT-PCR检测,均能检测出Ⅱ型GCRV的条带。以上结果说明,灌胃法可以作为一种新的方法,用于草鱼的GCRV人工感染实验。