跨膜蛋白基因克隆载体pMBL的构建及验证

自行设计一对引物,从质粒pUC18上扩增一段无启动子和信号肽的β-内酰胺酶基因(△P△SP Amp),以作为最终构建的载体克隆到带跨膜信号基因片段的报告基因。所设计的上游引物中依次带有分别处于3个不同阅读框架、且形成匹配粘性末端的3个酶切位点BglⅡ、BclI、BamHI,以便最终构建的载体捕获基因时的对位融合和表达。pET-28经BglI、Bst1107I双酶切,去除约2．5kh的lac I等基因的冗余片段,保留Kan抗性基因、复制原点、多克隆位点等结构,并消除BglⅡ位点,获得作为最终构建载体的抗性基因和基本骨架的过渡质粒pKan。△p△SP Amp基因经pGEM-T-EASY载体,克隆到pKan的EcoRI和XbaI间,得到在Kan平板中生长而在Amp和Kan双抗平板中不能生长的转化子pMBL-E质粒;经部分酶切补平自连,筛选得到消除HindⅢ位点端EcoRI位点的质粒,即得到用于跨膜蛋白信号基因片段捕获克隆的目的载体pMBL,大小为3．46kb。经酶切鉴定和测序,证明构建的载体与预期设计的一致。应用四环素抗性基因(Tet)片段对构建的跨膜蛋白基因克隆载体pMBL．的有效性进行了验证,在克隆人EcoRI和BglⅡ双酶切(0位)的载体中,Kan和Amp双抗平板筛选到阳性克隆子,经酶切和测序均显示Tet基因已对位插人,并启动了β-内酰胺酶的表达和跨膜分泌。由此证明：构建的跨膜蛋白克隆载体pMBL能有效捕获含启动子和信号肽序列的跨膜蛋白基因。     

鹅圆环病毒浙江永康株全基因组的克隆及序列分析

为研究水禽流感大规模爆发的机理,进行了水禽流感病例中并发病原,特别是免疫抑制性病原的检测研究。根据已发表的鹅圆环病毒(Goosecircovirus,GoCV)序列,设计了一对检测引物,对浙江永康禽流感病死鹅样品进行PCR扩增,获得与预期552bp大小相符的DNA片段,经测序确认为GoCV特异序列,推测样品中存在GoCV。根据测定的序列进一步设计反向扩增引物,经扩增、测序、拼接后获得GoCV全长基因组序列。基因组序列分析表明,浙江永康株GoCV_yk01全长1821bp,具有圆环病毒共同的与病毒复制相关的茎环结构和Rep蛋白保守基序等特征,它与德国、中国台湾发表的序列在全基因组水平有91%～93%的同源性,在Rep和外壳蛋白的氨基酸水平有94%～97%的同源性。应用ClustalW方法作进化树分析显示,GoCV_yk01序列与德国株及中国台湾株均不在同一分支。圆环病毒可以感染淋巴细胞等增殖快的细胞,引起免疫抑制,从而造成其他病原的并发和继发感染,怀疑GoCV可能在2004年初永康爆发的鹅流感中起到了一定的协同作用。该GoCV_yk01是中国内地首次检测确认并测定全基因组序列的鹅圆环病毒。