一种DHFR介导的可调控的腺嘌呤碱基编辑器的构建

摘要 目的：单碱基编辑器作为一种高效、精确、低脱靶的编辑系统,目前被广泛应用于生物体中。然而,Cas核酸酶本身的免疫原性具有引发机体免疫反应的潜在风险,可能阻碍其在基因治疗中的有效和安全使用。因而本研究旨在构建一种由DHFR介导的可调控腺嘌呤碱基编辑器（adenine base editor,ABE）。方法：将大肠杆菌来源的不稳定结构域-二氢叶酸还原酶（ dihydrofolate reductase,DHFR）的一种突变形式,融合于ABE的不同相对位置,构建数种DD-ABE载体。从已发表的内源基因靶点中挑选三个高效位点检测DD-ABE编辑水平。转染四种DD-ABE表达载体,用不同浓度TMP处理,通过Western Blot检测DD-ABE融合蛋白的表达水平。共转染DD-ABE与sgRNA质粒,通过基因组PCR扩增以及Sanger测序检测基因的编辑水平。结果：在构建的四种DD-ABE编辑器中,缺乏TMP的诱导,各组仅有非常少量的DD-ABE融合蛋白表达。TMP最佳工作浓度为10 μmol/L。DD-ABE载体加药组的蛋白表达水平以及基因编辑水平均高于未加药组。ABECD未加药组的碱基编辑效率最低,加药组的蛋白表达水平和编辑效率与ABEmax无明显差异。结论：本研究成功构建ABECD作为可调控的ABE,为其体内应用提供了新的技术依据。     

Wdr82调控小鼠胚胎干细胞体外的增殖和分化

Setd1a复合物和Setd1b复合物(Setd1a/b)是进化上功能高度保守的表观遗传调控因子,主要包括Setd1a/b、Wdr82、Wdr5、Rbbp5、Ash2L、Dpy-30、Hcf-1等,催化组蛋白H3第4位赖氨酸(H3K4)的甲基化,进而激活基因转录。Wdr82是Setd1a/b复合物中特有的非催化亚基,其在胚胎发育过程中的作用尚不清楚。该研究利用小鼠胚胎干细胞(moue embryonic stem cells,m ESCs)的体外培养和分化系统发现,在m ESCs分化过程中,Wdr82的表达水平显著降低。在m ESCs中敲低Wdr82后,m ESCs的增殖速度显著减缓,而其多能性不受影响。利用拟胚体分化体系发现,Wdr82敲低后,拟胚体的形成速度变慢,自主搏动的时间明显滞后。综上所述,该结果揭示了Wdr82在m ESCs体外增殖和分化过程中的重要作用。     

小鼠急性髓系白血病模型的构建

MLL基因的异常重排会引发急性淋巴系(ALL)和急性髓系白血病(AML)。该文详细阐述了利用逆转录病毒载体MLL-AF9构建小鼠AML模型的方法。该研究比较了免疫磁珠法与5-氟尿嘧啶(5-FU)方法富集骨髓细胞的效率,以及不同时间点收获的病毒对骨髓Lin-细胞感染效率的影响。通过流式检测发现, 5-氟尿嘧啶富集的骨髓Lin–细能够被48 h收获的病毒高效感染。受体鼠在移植了MLL-AF9感染的骨髓Lin–细胞60天后,外周血、骨髓、脾脏组织中均有大量的白血病细胞浸润, RT-qPCR也验证了白血病靶基因的表达上调,表明小鼠AML模型的成功构建。这项研究为从事白血病研究的科研人员提供了一种有效的小鼠急性髓系白血病模型,为研究白血病发病机理与研发白血病治疗药物提供有用的工具。     

鄱阳湖长江江豚的微卫星遗传多样性及发展预测

为了科学评估鄱阳湖长江江豚(Neophocaena asiaeorientalis asiaeorientalis)的遗传多样性并预测其发展趋势,研究基于124头活体长江江豚的血液样本及42头搁浅死亡长江江豚的组织样本,利用微卫星遗传标记对该种群的遗传多样性进行了评估,并利用BottleSim软件对该种群遗传多样性的发展趋势进行了模拟预测。研究结果显示,鄱阳湖长江江豚种群10个微卫星位点的平均等位基因数(N_a)为5.80、平均观察杂合度(H_o)为0.653、期望杂合度(H_e)为0.664,表现出中等程度的核DNA遗传多样性;在剔除死亡个体后,平均等位基因数下降至5.50,并且死亡个体在3个微卫星位点上具有3个稀有等位基因,表明非正常死亡将导致鄱阳湖种群遗传多样性下降。此外,模拟结果表明,如果保持当前有效种群(N_e=62)和雌雄性比(0.87:1),鄱阳湖长江江豚种群的遗传多样性将快速下降;而要实现100年内保存90%以上遗传多样性的目标,则其有效种群至少需要200头或者实际种群数量超过1000头。研...