人正常及骨关节炎软骨细胞体外培养的对照研究

摘要目的：研究人正常软骨细胞及骨关节炎软骨细胞的体外分离、培养及鉴定方法,对其生物学特性进行对照并评价其生物学活性。方法：取人创伤性截肢与骨关节炎全膝置换的无菌膝关节软骨,采用两步酶消化法分离培养人关节软骨细胞,并进行传代培养。通过倒置相差显微镜下观察细胞形态,绘制生长曲线,测细胞增殖,甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色对细胞进行对照研究。结果：骨关节炎软骨细胞形态似成纤维细胞,生长速度明显较正常软骨细胞慢。MTT测细胞增殖显示,第2．4、6代骨关节炎软骨细胞在相同时间点大都比同代正常软骨细胞增殖速度慢（P〈0．05）。甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组化染色显示,骨关节炎软骨细胞染色较正常软骨细胞浅,经多次传代后基本无着色。结论：正常软骨细胞5代以内细胞生长良好,生物学特性明显,5代以后出现去分化现象。骨关节炎软骨细胞增殖慢,生物学特征退变旱,符合软骨细胞退变的表现。这为骨关节炎在软骨细胞水平的研究提供了实验基础。     

WNT6基因在原发性骨肉瘤组织中的表达及其临床意义

目的:骨肉瘤是最常见的恶性骨肿瘤之一,好发于青少年,致残致死率高.因此,骨肉瘤的早期诊断、治疗及其发病原因和机制已成为现阶段骨肉瘤研究领域的主要方向之一.通过观察WNT6在骨肉瘤组织中的表达,探讨其在原发性骨肉瘤发生发展中的可能作用机制,为以WNT6为指标对原发性骨肉瘤的诊断和以WNT6为靶点进行原发性骨肉瘤生物学治疗提供理论依据.方法:收集70例原发性骨肉瘤、28例骨样骨瘤和25例骨软骨瘤标本的存档蜡块,应用SP免疫组织化学染色法检测组织中WNT6蛋白的表达情况,并应用统计学处理数据分析其与骨肉瘤临床病理参数及预后的关系.结果:WNT6在原发性骨肉瘤、骨样骨瘤和骨软骨瘤组织中的阳性表达率分别为90.00 ％(63/70)、14.29 ％(4/28)和12.00 ％(3/25).骨样骨瘤组织WNT6阳性表达率与骨软骨瘤组织相比差异无统计学意义(P＞0.05);原发性骨肉瘤组织WNT6阳性表达率明显高于骨样骨瘤组织和骨软骨瘤组织,差异均有统计学意义(均P＜0.05).WNT6在骨肉瘤组织中的表达与Enneking分期、肺转移和预后呈正相关关系.结论:WNT6在原发性骨肉瘤中的表达明显上调,WNT6表达与骨肉瘤的Enneking分期、年龄、肺转移等相关,同时WNT6高表达患者生存率降低,对骨肉瘤的诊断和预后评估具有重要价值,并在临床可能成为一个诊断原发性骨肉瘤的检测指标,为骨肉瘤的生物学治疗提供新的靶点.     

藿香蓟叶提取物对大鼠创伤性骨关节炎的治疗作用

摘要 目的：探究藿香蓟叶提取物（ACLE）对创伤性骨关节炎（PTOA）模型大鼠的治疗作用及其可能的分子机制。方法：SPF级雄性SD大鼠采用前交叉韧带切断法构建PTOA大鼠模型,然后将建模成功的大鼠随机分为模型组、藿香蓟叶提取物2.5 g组（ACLE 2.5 g组）、藿香蓟叶提取物5 g组（ACLE 5 g组）和藿香蓟叶提取物10 g组（ACLE 10 g组）,每组21只。另取21只SD大鼠设为假手术组,大鼠只执行前交叉韧带暴露手术,但是不切断。ACLE 2.5 g组、ACLE 5 g组和ACLE 10 g组大鼠在造模结束后分别灌胃给药,剂量分别为2.5 g/kg、5 g/kg和10 g/kg,持续给药处理8周。假手术组和模型组大鼠给予等量生理盐水每日灌胃处理,同样持续干预处理8周。给药结束后,收集各组大鼠的血清、膝关节灌洗液和膝关节软骨组织。采用HE染色（Mankin''s评分）和番红O+固绿染色（OARSI评分）评估大鼠关节损伤情况。采用ELISA试剂盒检测大鼠血清中ALP、BGP和CTX-Ⅰ水平,以及大鼠血清和关节灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-1β水平。采用试剂盒检测大鼠血清和关节灌洗液中MDA、SOD、GSH-Px和ROS水平。采用Western blot检测大鼠软骨组织中Aggrecan、SOX-9、Col Ⅱ、MMP-13、Wnt1、β-catenin、Bcl-2和Bax蛋白表达水平。结果：模型大鼠的膝关节软骨组织损伤严重,软骨层状组织结构遭受破坏;ACLE 2.5 g组、ACLE 5 g组和ACLE 10 g组大鼠膝关节软骨组织结构和病理状态均得到不同程度的恢复。与模型组比较,ACLE 2.5 g组、ACLE 5 g组和ACLE 10 g组大鼠Mankin''s和OARSI的评分值均降低（P<0.01）。与模型组比较,ACLE 2.5 g组、ACLE 5 g组和ACLE 10 g组大鼠血清中ALP和BGP水平升高,CTX-Ⅰ水平降低（P<0.05）。与模型组比较,ACLE 2.5 g组、ACLE 5g组和ACLE 10 g组大鼠血清和膝关节灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-?琢、NO和MDA水平均降低（P<0.05）,SOD和GSH-Px水平均升高（P<0.05）。与模型组比较,ACLE 2.5 g组、ACLE 5 g组和ACLE 10 g组大鼠关节软骨组织中Aggrecan、SOX-9、ColⅡ和Bcl-2蛋白表达水平均升高（P<0.05）,MMP-13、Wnt1、β-catenin和Bax蛋白表达水平均降低（P<0.05）。结论：ACLE能够降低PTOA大鼠膝关节软骨组织中炎症反应水平,增强抗氧化能力;抑制Wnt/β-catenin通路的过度激活,通过升高Aggrecan、ColⅡ、SOX-9和Bcl-2的表达,促进软骨细胞外基质的恢复,并抑制软骨细胞的凋亡,从而改善PTOA大鼠软骨组织损伤程度。     

姜黄素通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进骨折愈合

摘要 目的：探讨姜黄素治疗骨折的潜在应用价值及其对Wnt/β-catenin信号通路的可能影响。方法：本研究建立了胫骨骨折SD大鼠模型（模型组）,然后应用不同剂量的姜黄素（50、100和200 mg/kg/d）治疗胫骨骨折大鼠4周。治疗4周后,通过苏木精和伊红（HE）染色评价骨折区域的形态,通过ELISA法测定大鼠血清中TGF-β、BMP-2、OC和CTX-I水平。应用不同浓度的姜黄素（0、5、10、20、和50 μM）或Wnt/β-catenin信号通路抑制剂ICG-001（10 μM）处理成骨细胞3 d,然后检测细胞的ALP活性、PCNA和COL-1的含量及Wnt /β-catenin信号通路相关分子的表达水平。结果：不同剂量的姜黄素处理组大鼠的小梁状骨和胶原明显增多。与模型组相比,不同剂量的姜黄素处理组大鼠血清中的TGF-β、BMP-2和OC水平均升高,而CTX-I水平降低（P<0.05）;与模型组相比,不同剂量的姜黄素处理组大鼠骨折区域中的COL-1阳性率升高（P<0.05）,而COL-2水平未发生显著变化（P>0.05）。在药物干预3 d后,10和20 μM的姜黄素促进了细胞增殖,而100和200 μM的姜黄素抑制了细胞增殖（P<0.05）。与0 μM组比较,10 μM和20 μM的姜黄素组成骨细胞上清液中PCNA和COL-1水平及ALP活性水平均显著升高（P<0.05）。与模型组相比,不同剂量的姜黄素处理组大鼠骨折区域中的Wnt-3a和β-catenin mRNA和蛋白表达水平升高,而GSK-3β降低（P<0.05）。与姜黄素组相比,ICG-001处理后成骨细胞活力、ALP活性和β-catenin的表达水平均显著下降（P<0.05）。结论：姜黄素通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进骨折愈合并刺激成骨细胞的增殖和分化。