鱼腥藻苯丙氨酸脱氨酶的基因克隆、表达及最适反应pH改造

【目的】表达鱼腥藻苯丙氨酸脱氨酶(AvPAL),并经分子改造降低其最适反应pH。【方法】PCR克隆AvPAL编码基因,并在大肠杆菌中表达,用Ni2+亲和层析柱和凝胶柱纯化重组蛋白。利用GETAREA软件筛选与催化残基距离较近的暴露于酶分子表面的氨基酸位点,将其突变为带电性质不同的氨基酸,并对突变体进行酶学性质研究。【结果】在大肠杆菌中成功表达了AvPAL,纯化后得到电泳纯的重组酶。突变体E75Q和E75R的最适反应pH从8.5分别偏移到7.5和7.0。E75Q在pH 7.5时的比酶活较原酶提高了25%,在pH 6.5–9.5之间酶的稳定性良好,其最适反应温度为50 °C,在此温度下保温1 h酶活无显著变化。在最适反应条件下,E75Q的kcat/Km值较原酶提高了26.6%。【结论】改变AvPAL酶分子中起路易斯碱作用的关键氨基酸残基(质子受体)附近与之有相互作用的氨基酸的带电性质,降低了AvPAL的最适反应pH,提升了其在医疗领域的应用前景。     

C2H2＋Ar处理医用涤纶材料的细菌粘附

目的：对最常用心脏血管替代材料涤纶片作最新发展的具有全方位表面改性特征的混合等离子体浸没注入,以观察经处理后的涤纶片抑制细菌粘附的效果。方法：用多功能全方位等离子体浸没及离子注入机(PⅢ),用射频电源建立气体等离子体,对涤纶材料作全方位乙炔和氩气混合离子(C2H Ar)注入获取表面改性涤纶片。用金黄色葡萄球菌,表皮葡萄球菌,大肠杆菌,绿脓杆菌,白色念珠菌制取细菌悬液并作5-^125I-2’-脱氧尿嘧啶核苷(^125I-UDR)标记,再对改性涤纶材料作体外细菌动态粘附实验。结果：表面改性涤纶材料改变了亲水性和表面能,降低了水分子接触角。与未改性材料相比,改性涤纶材料抗细菌粘附能力有较明显提高。结论：混合离子(C2H2 Ar)表面改性涤纶片有良好的抗细菌和血小板粘附能力。     

酒精依赖大鼠不同脑区肌动蛋白结合蛋白的表达变化

目的：研究长期酒精暴露对大鼠不同脑区肌动蛋白结合蛋白cofilin表达的影响。方法：雄性SD大鼠24只,随机等分为慢性酒精暴露1月组（E1组）和2月组（E2组）,各饮酒组均设对照组（C1组、C2组）,每组大鼠6只。参照文献制作实验动物模型,给慢性酒精暴露组大鼠自由饮含低浓度乙醇（体积分数为6%）的水溶液,对照组大鼠正常饮自来水。撤除酒精后6 h进行戒断症状评分,并分别处死各组大鼠取脑组织。采用免疫组织化学方法检测各组大鼠前额叶皮质和海马CA1区cofilin蛋白的表达水平。结果：饮酒组大鼠撤除酒精后出现明显的戒断症状。在前额皮质区,E1组大鼠cofilin表达水平较C1组显著升高（P < 0.05）,E2组大鼠cofilin表达水平较C2组显著升高（P < 0.01）;在大鼠海马CA1区,E1组cofilin表达水平较C1组显著升高（P < 0.05）,E2组cofilin表达水平较C2组相比无显著差异（P > 0.05）。结论：长期酒精暴露可导致大鼠前额皮质及海马CA1区肌动蛋白结合蛋白的表达变化。     

Synthesis and blood compatibility of rutile-type titanium oxide coated LTI-carbon

Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｏｒｇａｎｓｗｈｉｃｈｈａｖｅｔｏｃｏｎｔａｃｔｗｉｔｈｂｌｏｏｄｆｏｒａｌｏｎｇｔｅｒｍ,ｓｕｃｈａｓａｒｔｉｆｉｃｉａｌｈｅａｒｔｖａｌｖｅｓａｎｄａｒｔｉｆｉｃｉａｌｈｅａｒｔ,ｎｅｅｄｇｏｏｄｂｌｏｏｄｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ.Ｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｉｓｏｔｒｏｐｉｃｐｙｒｏｌｙｔｉｃｃａｒｂｏｎ(ＬＴＩｃａｒｂｏｎ)ｉｓｕｓｕａｌｌｙｕｓｅｄｆｏｒｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎｏｆａｒｔｉｆｉｃｉａｌｈｅａｒｔｖａｌｖｅｓｎｏｗ.Ｂｕｔｉｔｓｂｌｏｏｄｃｏｍｐａｔｉｂｉｌ…     

金红石型氧化钛覆膜热解碳的制备及血液相容性研究

用离子束增强沉积 (IBED)方法 :即在氧气氛中 ,通过惰性气体Xe+离子轰击和Ti的电子束蒸发进行了氧化钛薄膜的合成 .X射线衍射分析表明 ,用离子束增强沉积技术合成的薄膜为金红石结构 ,具有 ( 10 0 )择优取向 .用背散射技术分析了薄膜的成分 ,发现薄膜的O/Ti基本上接近 2∶1.薄膜中含有一定量的Ti2 +和Ti3+.体外试验及动物体内试验结果表明 ,金红石型氧化钛薄膜具有比目前临床应用的热解碳更好的血液相容性 .并认为 ,金红石型氧化钛覆膜热解碳极可能成为新的人工心脏瓣膜材料 .     

江苏连云港与盐城海域口虾蛄种群的遗传多样性

为了解口虾蛄野生种群的遗传多样性水平,采集了4个不同地理种群的口虾蛄44个样品,利用线粒体细胞色素c氧化酶Ⅰ亚基序列为分子标记,初步分析了口虾蛄野生群体的遗传多样性及遗传结构。研究共获得627bp的COⅠ序列,检测到27个单倍型,30个变异位点。在4个种群中,燕尾港与射阳种群、赣榆与连岛镇种群、赣榆与燕尾港种群之间存在明显的遗传分化,但在贝叶斯系统树中未形成明显的地理分化格局;4个野生种群都有高的单倍型多样性水平和相对低的核苷酸多样性水平;歧点分布及中性检验均支持口虾蛄野生种群在历史上发生快速扩张事件。     

Tyr78-loop对鱼腥藻来源苯丙氨酸脱氨酶活性的影响

【背景】MIO(Methylidene-imidazol-5-one)依赖型酶中,催化因子Tyr所在Loop(Tyr78-loop)的灵活性显著影响酶学性质。【目的】探讨Tyr78-loop对鱼腥藻来源苯丙氨酸脱氨酶酶活的影响,以提高其反应活性。【方法】将该酶的Tyr78-loop进行分子改造,筛选出酶活提高的突变体,并对突变体的酶学性质进行研究。【结果】突变体S73N、E95V、E95K和S73N/E95K在37°C、pH 8.5下比活分别比原酶提高了34%、30%、18%和35%。蛋白三维结构模拟推测在突变体S73N、E95V和E95K中,位于α螺旋与Tyr78-loop交界处的Asn73、Val95和Lys95与附近氨基酸的氢键作用力数目减少,一定程度上增加了Tyr78-loop的柔性。【结论】Ser73位和Glu95位氨基酸的突变增加了Tyr78-loop的灵活性,提高了苯丙氨酸脱氨酶的酶活。     

不同固定液对Vero E6细胞形态和染色的影响及在病毒噬斑分析中的应用

病毒噬斑形成实验是确定病毒滴度的重要方法,其中噬斑染色是非常关键的步骤,而良好的固定液不仅能够维持细胞形态,也能起到助染作用,是有效识别病毒噬斑的关键因素.为了研究不同固定液对Vero E6细胞形态和结晶紫染色效果的影响,本研究采用五种固定液对Vero E6细胞进行固定(100％甲醇、4％甲醛、10％甲醛、75％乙醇和95％乙醇).以只加PBS缓冲液的细胞作为对照组.细胞固定30 min后利用1％结晶紫进行染色.利用光学显微镜和肉眼观察细胞形态,从而评价固定和染色效果.结果 显示,10％甲醛的细胞固定效果最佳,细胞形态良好,细胞染色均匀且着色深,利用该固定剂能在病毒噬斑实验中很好的识别噬斑,是Vero E6较为理想的固定剂.     

稳定表达小鼠CD40L的NIH3T3细胞系的建立及其在B细胞培养和激活中的应用

该研究构建小鼠CD40L真核表达重组质粒pcDNA3.1-mCD40L,通过电转法将重组质粒转至NIH3T3细胞中。利用G418对转染后细胞进行压力筛选,获得稳定转染细胞株。提取稳定转染细胞株RNA,通过RT-PCR法检测Neo基因的mRNA表达情况。分离稳定转染细胞上清,利用ELISA法检测小鼠CD40L蛋白水平的表达情况。RT-PCR结果显示,Neo基因能够在稳定转染细胞中表达,ELISA结果显示,获得的稳定转染细胞株NIH3T3-mCD40L细胞上清中CD40L的表达量高达1.286 ng/mL。进一步活性研究表明,该细胞系能够在体外与IL-2和IL-21共同作用培养B细胞至14天,并刺激B细胞产生特异性抗体。该细胞系的成功构建,为利用体外B细胞分离培养和活化法分离特异性单克隆抗体奠定了良好的基础。     

一种基于胶体微晶纤维素的改良病毒蚀斑测定法的建立与评价北大核心CSCD

胶体微晶纤维素(avicel)是一种由微晶纤维素(microcrystalline cellulose, MCC)和羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose,CMC)制成的混合物,可用于病毒蚀斑测定。常用的avicel由FMC公司生产,其MCC和CMC比例相对固定,无法很好地适应所有类型病毒的蚀斑测定实验。本研究通过对比不同的MCC和CMC配制比例对avicel在病毒蚀斑测定作用的影响,建立了一种操作简便、实用性好和稳定性好的改良avicel病毒蚀斑测定法。为了配制不同浓度MCC和CMC的混合物,本研究制备出12种2×avicel覆盖层,测定其总体黏度及底层黏度,评估其与传统覆盖层相比,使用时的操作难易程度。进一步将12种2×avicel覆盖层制备成avicel-DMEM营养覆盖层,测定96孔板中猪流行性腹泻病毒滴度,比较12种avicel覆盖层及传统覆盖层蚀斑大小、清晰度、稳定性及滴度准确性等的差异,筛选出最佳测定方法。结果显示,12种2×avicel覆盖层中,除4.8%MCC+1.4%CMC和4.8%MCC+1.0%CMC外,其余2×avicel覆盖层在实际使用中均比2×CMC覆盖层更容易吸取和配制营养覆盖层。最后,利用avicel病毒蚀斑测定法测定96孔板中猪流行性腹泻病毒滴度,结果显示CMC浓度越高蚀斑越小,其中终浓度为0.6%MCC+0.7%CMC的avicel覆盖层测定蚀斑染色最清晰,准确度与传统覆盖层相似,但操作较传统覆盖层更简便。综上所述,本研究建立了一种操作简便、实用性好和稳定性好的改良avicel病毒蚀斑测定法,为病毒的病原学、抗病毒药物及疫苗等相关研究的展开提供了良好的实验基础。