一种测定多个目的基因扩增的简易方法——差异PCR扩增法

一种建立在PCR的基础上,不使用同位素能快速安全地检测基因组中某一目的基因扩增程度的简易方法。此法所需DNA样品量少、灵敏度高,对于为观察细胞株而制备的小量样品或者石蜡包埋及福尔马林处理后的组织切片中某种基因的扩增尤为适宜。可做为一种辅助诊断手段推广应用到临床实验室。     

胃癌及癌旁组织中Rb基因缺失和重排的研究

<正> Rb基因即视网膜母细胞瘤敏感基因,被认为是一种抑癌基因。它在正常细胞中存在,而在视网膜母细胞瘤中有缺失。将正常的Rb基因导入有Rb基因缺失的视网膜母细胞瘤和骨肉瘤细胞内,可以抑制上述两种肿瘤细胞的生长。目前已在多种人类肿瘤中如骨肉瘤、纤维肉瘤、小细胞肺癌、乳腺癌等发现有Rb基因的缺失。胃癌组织中Rb基因丢失的研究未见报道。本实验使用Southern杂交方法在胃癌及癌旁组织中进行Rb基因缺失和重排的研究,探索Rb基因在胃癌发生、发展中的作用。     

从石蜡包埋和甲醛浸泡组织中提取DNA进行PCR扩增的研究

如何从石蜡包埋组织中高质量的提取DNA从而进行分子生物学特别是基因工程方面的科研工作,目前在国内尚未见报道。我们采用二甲苯或水浴法对2块胃癌石蜡包埋组织进行脱蜡,并提取、纯化了DNA,进行PCR扩增,获得了成功。另外对用甲醛浸泡的组织其DNA的受损程度与上述进行了比较,现报告如下。     

应用寡聚核苷酸检测c-Ha-ras癌基因点突变

人工合成的寡聚核苷酸探针能够准确地检测出克隆的c-Ha-ras癌基因第12位密码子是否发生点突变。将多聚酶DNA链延伸反应(PCR)与寡聚核苷酸探针结合起来测定组织或细胞株中的单拷贝基因c-Ha-ras第12位密码子的点突变,获得满意的结果。此方法的建立,有助于肿瘤的早期诊断、分型等方面的研究。     

反义及正义表达癌基因c-Ha-ras重组质粒的构建

c-Ha-ras癌基因通过其产物p21蛋白的点突变或过量表达使细胞恶变。国外一些实验室的初步研究表明,导入一段与c-Ha-ras基因转录出的mRNA(sense RNA,正义RNA)顺序互补的RNA(anti-sense RNA,反义RNA),有可能通过阻断DNA复制,RNA转录或蛋白质翻译等过程,减少p21蛋白的合成,从而使转化细胞逆转。为了进一步系统研究反义c-Ha-ras RNA在转化细胞逆转中的     

癌基因Ha-ras在转化和未转化细胞中表达和调控的差异

以前的工作曾用人胃癌基因Ha-ras转化了大鼠全胚细胞系Ratl细胞,得到转化细胞Rat3-3。克隆了Ha-ras癌基因6.6kb及其上游区2.5kb DNA片段,并发现2.5kb有Alu重复顺序,说明这个片段是来源于人胃癌细胞,虽族观察到p21蛋白编码12位点突变,我们又发现转化的Rat3-3细胞的Ha-ras mRNA水平比未转化的Rat1高大约五倍;通过DNase I超敏感实验证明只有转化细胞核中的Ha-ras基因对DNaseI敏感,1μg/mL的DNaseI就有明显的降解,而未转化细胞Rat1细胞核的Ha-ras基因在15μg/mL的DNaseI中也未发现有任何降解;另外还发现转化细胞核有一种能为Ha-ras基因上游区2.5kb特异结合的核蛋白,分子量大约35kD,此核蛋白不能与6.6kb Ha-ras基因本身结合,在未转化细胞中未发现此蛋白。从这些结果推测,癌基因Ha-ras的活化,除了点突变外,还可能存在另一条活化途径,即它的上游区可能有类似增强子的调控区。     

人胃癌细胞株BGC-823 DNA二轮转化细胞基因组文库的构建及其转化基因的克隆

以人胃癌细胞株BGC-823 DNA二轮转化的鼠成纤维细胞为材料,用λ噬菌体EMBL_3,作克隆载体,构建了转化细胞的基因组文库。用~(32)P标记的人Alu重复顺序和原癌基因c-Ha-ras为探针,对100万基因文库噬斑进行原位杂交筛选,找出了两个可以同时与上述探针杂交的阳性克隆。经对两个阳性克隆DNA进行分子杂交表明,它们均含有来自人胃癌细胞株BGC-823的转化基因Ha-ras,进一步运用质粒载体pBR322对这一转化基因进行次级克隆,并进行了限制性内切酶图谱的初探,从而为研究胃癌转化基因的结构、DNA序列及与原癌基因的异同奠定了基础。     

以寡聚核苷酸为探针对癌基因Ha-ras点突变的测定

<正> 基因中一个核苷酸的改变(点突变)是原癌基因活化的途径之一。核苷酸序列分析表明,我们从胃癌细胞系中克隆出的癌基因Ha-ras,就是由于其编码区第35位核苷酸从鸟嘌呤(G)变为胸腺嘧啶(T)而被激活的。测定基因的点突变除了序列分析方法之外,还有比较简单、经济的寡聚核苷酸探针分子杂交等方法。我们按照正常的原癌基因c-Ha-ras和胃癌     

一种测定癌基因c-Ha-ras点突变的简易方法——PCR-RFLP法

利用多聚酶DNA链延伸反应与限制性内切酶酶解片段长度多态性分析相结合,可简单、迅速、准确地对胃癌组织及细胞株DNA中癌基因c-Ha-ras第12位密码子是否存在点突变进行测定。这个方法是使用非同位素方法对单拷贝基因点突变进行检测的首次报道。     

胃癌和癌旁组织癌基因c-Ha-ras第12位密码点突变测定的研究

 <正> 胃癌是我国发病率、死亡率最高的肿瘤之一,癌基因c-Ha-ras第12位密码子的点突变(鸟嘌呤突变为胸腺嘧啶)是其激活的重要方式之一,这一突变使c-Ha-ras的产物p21蛋白第12位氨基酸从正常的甘氨酸变为胃癌中的缬氨酸~[1-4]。点突变的测定可成为临床医生判断术后患者预后的有用指标,为拟定更有效的治疗方案提供帮助。据有关资料统计,点突变阳性及阴性患者的术后生存期分别为11.3±4.5个月和>29±8.1个月,两组间有显著差异