用于药物评价的体外心脏组织模型研究进展

候选药物对心脏的毒副作用是其在开发过程中被淘汰的重要原因之一.传统药物评价所采用的动物模型存在种属差异、成本高、效率低等缺陷.因此,近年来随着干细胞和生物打印等技术的快速发展,体外心脏组织模型的构建受到了越来越多地关注.本文追踪体外心脏模型构建的起源与发展,综述模型所利用的心肌细胞来源以及二维、三维模型构建的相关技术与方法,着重阐述心肌组织模型血管化的重要性及研究进展,并对该领域未来的发展方向进行展望,以期为体外心肌组织模型在药物评价方面的研究和应用提供新思路.     

人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白在CHO细胞中的表达

干扰素α2b(interferonα2b,IFNα2b)是一种用于病毒性疾病和肿瘤性疾病治疗的多功能细胞因子,因其在体内的半衰期短限制了其在临床上的应用。将IFNα2b连接到人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)的C端,构建融合蛋白HSA-IFNα2b。构建含融合蛋白的真核表达质粒p MH3/HSA-IFNa2b,经电转的方法转入中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞中。经G418抗性压力筛选和目的蛋白的表达量筛选,最终获得一株高表达的稳定细胞株(CHO/p MH3/HSA-IFNa2b)。表达的目的蛋白经Western blot验证显示,产物具有IFNα2b和HSA的双抗原性。经悬浮驯化稳定后,通过批次筛选得到一株稳定的高克隆表达株,产量约为65mg/L,进一步选取高表达克隆株在悬浮驯化中不同代数进行批次培养,不同代数之间蛋白质的表达量和生长情况没有明显的差异,获得一株稳定遗传表达的单克隆细胞株,3L摇瓶的流加培养结果显示,最佳发酵时间为15天,蛋白质表达量为121mg/L。经离心获得的发酵液,经两步纯化后获得蛋白质纯度高达96.8%的目的蛋白,总回收率为22.3%。参照《中国药典》2015版对IFNα2b的检测方法,结果显示,CHO表达的HSA-IFNα2b比活性为4.16×106IU/mg。首次将HSA-IFNα2b在哺乳动物细胞CHO中构建表达,表达获得高活性的HSA-IFNα2b融合蛋白。     

EGFR突变与EML4-ALK融合共存的非小细胞肺癌的临床病理特征及治疗分析

目的:探讨表皮生长因子受体(EGFR)基因突变与棘皮动物微管相关样蛋白4与间变性淋巴瘤激酶(EML4-ALK)融合基因共存(以下简称双基因异常)的非小细胞肺癌的临床病理特征及治疗策略。方法:回顾性收集并分析2012年1月至2016年12月我院收治的EGFR突变与EML4-ALK融合基因共存的非小细胞肺癌患者的临床资料及病理特点。结果:11例双突变非小细胞肺癌占医院同期入院非小细胞肺癌患者的0.68%(11/1620);男性6例,女性5例;年龄23-70岁,平均年龄51.6岁;11例患者均不吸烟;腺癌9例,肉瘤样癌2例;临床分期,ⅠA期3例,ⅡB期1例,ⅢA期1例,ⅢB期1例,ⅠV期5例;6例行手术治疗,4例使用传统化疗,最好疗效为稳定(SD),最长无进展生存期(PFS)为6月;5例患者使用表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKⅠ)治疗,使用EGFR-TKⅠ最好疗效为部分缓解(PR),PFS为3-23月,中位PFS为9月;截止2017年12月,死亡4例,11例患者的生存时间为1-67月,中位存活时间为21月。结论:EGFR基因突变与EML4-ALK融合基因共存型非小细胞肺癌临床少见,多见于不吸烟或少吸烟的肺腺癌患者,双基因异常的非小细胞肺癌的靶向药物的治疗缺乏统一性,有待进一步研究,基于EGFR及EML4-ALK的磷酸化水平或肿瘤突变负荷选择靶向药物的个体化精准治疗是非常重要的。     

双向电泳技术进展及在动物和植物科学研究中的应用

综述了双向电泳技术的原理、每一步骤的研究进展及其在动物和植物科学研究中的应用。     

GLP-1类似物活性检测细胞模型的建立及其功能分析

为探索GLP-1类似物活性检测模型在活性检测过程中影响稳定性与重复性的因素,该文以中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞为模型细胞,构建真核表达载体p EGFP-N1/h GLP-1R-EGFP,并将其转染至CHO中,经过G418抗性筛选和流式细胞仪分选富集后有限稀释,筛选获得一株稳定高表达的单克隆细胞株。倒置荧光显微镜分析、流式细胞术分析以及RT-PCR实验结果显示,此检测模型转录和翻译了h GLP-1R-EGFP基因,并且表达的受体蛋白质位于细胞膜侧。以利拉鲁肽和艾塞那肽作为模型药物进行活性检测分析,结果显示,该检测模型具有极高的药物灵敏度,不同代数模型细胞测活相对稳定。该文还进一步探索了影响GLP-1类似物EC50测量值的因素,主要包括模型细胞受体表达量、胎牛血清以及其单一组分BSA。综上所述,构建的细胞模型在检测GLP-1类似物活性中,具有较好的稳定性和可重复性,为GLP-1类似物的药物筛选与活性评价提供方便可靠的模型基础。     

不同刈割强度对牧草地上部和地下部生长性状的影响

研究了不同刈割强度对牧草地上部和地下部生长状况的影响.结果表明,适度刈割可提高牧草地上部植株的再生能力.刈割后牧草再生叶片的叶绿素总量变化不大,而叶绿素a/b比值有所增加,轻刈割和重刈割的牧草叶绿素a/b比值分别增至1.59∶1和1.52∶1、不刈割为1.22∶1,有利于增强植物的光合作用.与不刈割处理相比,在刈割初期,重刈割处理下柱花草根系总长、总表面积和平均直径分别下降了54.9%、66.5%和27.2%,根系活力显著下降;但在中后期,刈割处理的牧草地下部根系形态指标活力可恢复到更高的水平.从一年两次收获的累计生物量来看,以轻刈割最高,为3 179.8 g·m^-2,重刈割次之,为3 006.1 g·m^-2,不刈割最低,为2 936.98 g·m^-2,说明一年两次刈割可以提高牧草产量.     

利用GAP启动子在毕赤酵母中表达与纯化GLP-1类似物

胰高血糖素样肽-1(GLP-1)能提高II型糖尿病患者β胰腺细胞的胰岛素分泌量并能促进β胰腺细胞增殖,是潜在的糖尿病治疗药物。设计一种GLP-1类似物AGGH,即GLP-1(A2G)的二联体与人血清白蛋白(HSA)的N端连接,并在融合蛋白GGH前添加一个丙氨酸(A)。PCR获得融合基因aggh,将融合基因连接到p GAPZαA质粒中。在酵母中利用甘油醛三磷酸脱氢酶(GAP)启动子组成型表达外源蛋白AGGH。研究结果显示:筛选获得表达重组菌株,基因组PCR和western-blot验证正确;以葡萄糖为最优碳源培养下,表达量达到68 mg/L;5 L发酵罐中,发酵52 h蛋白产量最高达238 mg/L。蛋白经四步纯化后,获得纯度为95.8%的AGGH融合蛋白。与利用醇氧化酶1(AOX1)启动子表达的AGGH比较,发现两者产量和活性没有明显差异。但是,GAP启动子表达获得AGGH融合蛋白更加方便,且发酵时间减少了27.8%(20 h)。     

稳定表达GLP-1类似物的CHO细胞株的构建及培养工艺研究

胰高血糖素样肽-1(Glucagon like peptide-1,GLP-1)是一种治疗II型糖尿病的潜在药物,针对其在体内半衰期短和在酵母中表达的批次间不稳定等问题,课题组前期对其进行改造,成功利用p MH3载体在中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞中表达人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)融合蛋白NGGH[6×His-tag+Ek+2×GLP-1(A2G)+HSA]。现利用新型载体pcDNA3.1,构建含融合蛋白的真核表达质粒pcDNA3.1/NGGH,经电击转染转入CHO细胞中。G418抗性压力筛选后利用一种新型的细胞成像系统高效快速地筛选出高表达单克隆株。表达的目的蛋白经WB(Western blot)验证显示,产物具有GLP-1和HSA的双抗原性。经悬浮驯化稳定后,通过批次筛选得到一株稳定的高表达细胞株,产量为58mg/L。利用5L AP20激流式生物反应器扩大培养重组细胞,对p H和溶氧控制条件进行了优化。结果显示,在p H6.8~7.4,溶氧(dissolved oxygen,DO)两相控制的条件下,蛋白质最终表达量可达148mg/L。     

运动神经元特异性荧光报告系统的建立

人类诱导多能干细胞 (Human induced pluripotent stem cells,hiPSCs) 具有向人体多种类型细胞分化的潜能,其定向分化的运动神经元 (Motor neurons,MNs) 是众多运动神经元疾病的重要体外模型之一。为简化MNs的鉴定方法,通过慢病毒载体将MNs特异性启动子HB9及其控制下的红色荧光蛋白 (Red fluorescent protein,RFP) 基因转入hiPSCs分化而来的神经干细胞 (Human neural stem cells,hNSCs),经抗生素筛选,获得稳定的阳性细胞株hNSCs-HB9-RFP-Puro。而后,阳性细胞株感染过表达MNs定向分化转录因子的慢病毒LV-Ngn2-Sox11-GFP和LV-Isl1-Lhx3-Hygro,诱导MNs定向分化。诱导分化所得的细胞展现出神经元样结构,并在特异性启动子HB9的作用下表达RFP;同时也表达神经元相关标记物β微管蛋白 (β-tubulin) 和乙酰胆碱转移酶 (Choline acetyltransferase,ChAT),鉴定为成熟的MNs。该荧光报告系统为MNs的定向分化及鉴定提供了一个更加直观的方法,有效促进了MNs在疾病模型和药物筛选等领域的广泛应用。     

抗甲型流感鸡卵黄抗体的制备及效价测定

目的:研究抗甲型流感卵黄抗体的制备与纯化,并探讨其效价随免疫时间的变化关系。方法:用灭活甲型流感病毒复合抗原免疫蛋鸡,用PEG6000对卵黄抗体进行分离提取,SDS-PAGE法对其进行分子量测定,考马斯亮蓝法对其含量和纯度进行测定,用微量凝集法检测蛋鸡血清抗体和卵黄抗体的效价。结果:提取得到的卵黄抗体重链分子量为66 kDa、轻链分子量分26 kDa,每毫升卵黄液可得到纯度为95.80%的卵黄抗体9.98mg,回收率93.01%;高效价持续时间90 d以上;免疫蛋鸡血清和卵黄中3种特异性抗体的消长规律基本相似,但抗体水平之间存在明显的差异。结论:采用灭活甲型流感病毒复合抗原免疫蛋鸡可制备高效价、高纯度抗甲型流感卵黄抗体,为卵黄抗体在甲型流感防治中的应用研究奠定了基础。