人骨形成蛋白-2C端102肽的诱骨活性

为分析更短的Hbmp-2C端肽是否具有诱骨活性 ,寻求新型的有诱骨活性的基因工程Hbmp-2产品。利用温度诱导的大肠杆菌表达系统表达肽段长度为102个氨基酸的Hbmp-2C端肽及其Cys的突变体。表达产物经纯化复性后 ,植入小鼠肌袋模型中测试其诱骨活性。获得了能稳定表达Hbmp 2C端肽的工程菌 ,测序结果与预期的序列完全一致。表达产物以包涵体形式存在 ,表达量占细胞总蛋白的 3 0 %。产物经纯化复性后 ,小鼠肌袋模型测试结果表明 :Hbmp 2 10 2肽仍具有诱骨活性 ,而将C端第一位Cys突变的 10 2肽诱骨活性丧失。实验表明 :比Hbmp 2成熟肽 ( 114个氨基酸 )更短的C端 10 2肽仍具有良好诱骨活性 ,这 10 2肽N端第一个Cys对其诱骨活性可能是必需的。     

人骨形成蛋白-3成熟肽cDNA的扩增、克隆和序列测定

骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)作为TGF-β超家族成员,可以诱导未分化的间质细胞向软骨细胞分化,然后通过软骨内成骨形成骨组织,对难治性骨折的愈合及各种骨缺损的修复有明显的促进作用。另外,BMP在胚胎发生和神经发育过程中也起重要作用。但是由于BMP在骨组织中含量甚微,提取方法繁琐,故不能满足临床应用和基础研究需要,随着人BMP(hBMP)1～13 cDNA基因的克隆,人们已在COS、CHO等真核细胞中表     

重组人骨形成蛋白-3成熟肽的表达、纯化及诱骨活性的研究*

推测人骨形成蛋白-3羧基端的127氨基酸的肽段为其成熟肽(hRMP 3m)。将编码此成熟肽的cDNA插入含PL启动子的表达质粒pDH中,构建表达质粒pDH-B-3m,转化大肠杆菌DH5α。42℃热诱导6h后表达量达到最高水平,约占菌体总蛋白28％;表达产物以包涵体形式存在。包涵体经分离和洗涤后．溶解于尿素,在变性溶解状态下经阳离子交换层析,目的蛋白纯度至少在95％以上。再经稀释复性。然后将纯化、复性的重组人骨形成蛋白3成熟肽(rhBMP－3m)植入小鼠肌肉间隙,于不同时间取材观察,在局部可见典型的软骨形成、软骨内成骨以及骨组织形成的过程,证实所制备的rhBMP－3m具有明显的异位诱骨活性。     

人骨形成蛋白3在昆虫杆状病毒表达系统中的表达、纯化及其诱骨活性检测

为了在昆虫杆状病毒系统中表达人骨形成蛋白 3(humanbonemorphogeneticproteoin3,hBMP3) ,检测表达产物的诱骨活性 .将hBMP3全长cDNA 1416bp克隆入转移载体K8中 ,再与病毒DNA经脂质体包裹后转染昆虫细胞Sf9.重组病毒经蓝白筛选后 ,用PCR方法扩增目的基因片段进行初步鉴定 .收集重组病毒的转染上清 ,肝素亲和层析纯化目的蛋白 .SDS PAGE和Western印迹进一步鉴定此蛋白 .体外培养MC3T3 E1细胞 ,经目的蛋白刺激后 ,检测细胞内碱性磷酸酶 (ALP)活性 .并将目的蛋白进行小鼠体内肌肉包埋实验 ,检测其异位诱骨活性 .结果显示 ,肝素亲和层析可以收集 1个高的洗脱峰 .SDS PAGE显示 ,非还原型样本为 32kD的二聚体蛋白带和少量 16kD单体蛋白带 ;还原型样本仅有相应大小的单体蛋白带 ,纯度达 80 % .Western印迹在相应位置呈阳性染色 .此蛋白刺激小鼠成纤维细胞 4 8h后 ,胞内ALP的活性增高 ,经rhBMP3作用后的细胞MTT染色减弱 .在小鼠股部肌肉内包埋蛋白样品 2～ 3周 ,组织学检测有成骨组织生成 .说明hBMP3在此套系统中获得了表达 .表达产物在体外可以刺激成骨细胞的分化 ,却抑制细胞的增殖 .小鼠体内异位诱骨实验进一步证实表达产物具有成骨活性