重组人骨形成蛋白-3羧基端肽在大肠杆菌中表达及其诱骨活性

以双顺反子表达载体,在大肠杆菌中经ＩＰＴＧ诱导表达了人骨形成蛋白－３羧基端肽段（ｈＢＭＰ－３Ｃ）,表达量占菌体总蛋白量的１８．５％．目的蛋白为２５ｋＤ、含ｈＢＭＰ－３Ｃ端２１５个氨基酸残基组成的肽段,包括ｈＢＭＰ－３成熟肽和一部分前肽．表达产物以包涵体的形式存在,用含ＴｒｉｔｏｎＸ－１００的洗涤液和５ｍｏｌ／Ｌ以下脲溶液连续洗涤,可获得较高纯度的重组人骨形成蛋白－３Ｃ端肽．经复性处理成可溶性蛋白,植入小鼠肌肉内,第１４ｄ组织切片显示有软骨细胞和软骨基质形成,第２１ｄ可见成骨细胞和骨基质形成．将ｒｈＢＭＰ－３Ｃ与脱矿去免疫原性异种骨粒复合后作小鼠肌肉植入试验,２１ｄ组织切片上可见硬质骨形成．结果表明：大肠杆菌表达的ｈＢＭＰ－３Ｃ经复性后具有诱骨活性,糖基化并非ＢＭＰ－３活性所必需．     

重组人骨形成蛋白-3成熟肽的表达、纯化及诱骨活性的研究*

推测人骨形成蛋白-3羧基端的127氨基酸的肽段为其成熟肽(hRMP 3m)。将编码此成熟肽的cDNA插入含PL启动子的表达质粒pDH中,构建表达质粒pDH-B-3m,转化大肠杆菌DH5α。42℃热诱导6h后表达量达到最高水平,约占菌体总蛋白28％;表达产物以包涵体形式存在。包涵体经分离和洗涤后．溶解于尿素,在变性溶解状态下经阳离子交换层析,目的蛋白纯度至少在95％以上。再经稀释复性。然后将纯化、复性的重组人骨形成蛋白3成熟肽(rhBMP－3m)植入小鼠肌肉间隙,于不同时间取材观察,在局部可见典型的软骨形成、软骨内成骨以及骨组织形成的过程,证实所制备的rhBMP－3m具有明显的异位诱骨活性。     

大肠杆菌中高效表达rhBMP-4的探讨及初步活性测定

目的 在大肠杆菌中表达具有生物活性的rhBMP-4。方法 在不改变氨基酸序列的前提下,以全基因合成的方式对人BMP-4成熟肽基因全长进行定点突变,将之重组入pET-3c表达载体并转化至大肠杆菌BL21(DE)plysS。IPTG诱导和包涵体复性后,利用C2C12细胞横向成骨细胞分化实验以及小鼠肌袋异位骨形成实验检测其活性。 结果 获得0.348 kb的BMP-4 DNA序列,表达的目的蛋白主要以包涵体的形式存在。经纯化及复性后,体内与体外的活性检测表明rhBMP-4有良好的诱骨生成活性。结论 该方案能够实现rhBMP-4在大肠杆菌中的高效表达。     

重组人骨形成蛋白—3成熟肽的表达,纯化及诱骨活性的研究

推测人骨形成蛋白３羧基端的１２７氨基酸的肽段为其成熟肽（ｈＢＭＰ３ｍ）。将编码此成熟肽的ｃＤＮＡ插入含ＰＬ启动子的表达质粒ｐＤＨ中,构建表达质粒ｐＤＨＢ３ｍ,转化大肠杆菌ＤＨ５α。４２℃热诱导６ｈ后表达量达到最高水平,约占菌体总蛋白２８％;表达产物以包涵体形式存在。包涵体经分离和洗涤后,溶解于尿素,在变性溶解状态下经阳离子交换层析,目的蛋白纯度至少在９５％以上。再经稀释复性。然后将纯化、复性的重组人骨形成蛋白３成熟肽（ｒｈＢＭＰ３ｍ）植入小鼠肌肉间隙,于不同时间取材观察,在局部可见典型的软骨形成、软骨内成骨以及骨组织形成的过程,证实所制备的ｒｈＢＭＰ３ｍ具有明显的异位诱骨活性。     

重组人骨形成蛋白—3羧基端肽在大肠杆菌中表达及其诱骨活性

以双顺反子表达载体,在大肠杆菌中经ＩＰＴＧ诱导表达了人骨形成蛋白－３羧基端肽段（ｈＢＭＰ－３Ｃ）,表达量占菌体总蛋白量的１８．５％。目的蛋白为２５ｋＤ、含ｈＢＭＰ－３Ｃ端２１５个氨基酸残基组成的肽段,包括ｈＢＭＰ－３成熟肽和一部分前肽。表达产物以包涵体的形式存在,用含ＴｒｉｔｏｎＸ－１００的洗涤液和５ｍｏｌ／Ｌ以下脲溶液连续涤,可获得较高纯度的重组人骨形成蛋白－３Ｃ端肽,经复性处理成可溶性蛋白,植     

人Leptin基因在大肠杆菌中的高效表达、纯化及其生物学活性研究

将人Leptin表达质粒pBV220-OB转化E.coliJM109,经热诱导获得了目的蛋白的表达。经SDS-PAGE鉴定分析,表达产物以包涵体形式存在,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的40%以上。通过包涵体分离,Sephacryl S200HR凝胶和DEAE52离子交换层析及Hypersil C18柱反相色谱纯化,获得纯度在95%以上,内毒素含量小于10EU/mg的高纯度的重组人Leptin。Western-blot鉴定表明,纯化表达产物能和抗Leptin抗体特异性结合;蛋白质N端15个氨基酸序列分析结果和预期的序列一致。纯化产物经复性处理,其分子中Cys96和Cys146形成二硫键。体内活性检测显示,纯化和复性的rh-Leptin明显抑制BALB/c小鼠的进食和体重增长,提示其具有明显的生物学活性。     

人骨形成蛋白－2AcDNA基因工程产物诱骨活性的形态学证明

人骨形成蛋白２Ａ（ｈｕｍａｎｂｏｎｅｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ２Ａ,ｈＢＭＰ２Ａ）ｃＤＮＡ３′端５６７个核苷酸插入表达载体ＰＳＧ４Ｔ－２中,在大肠杆菌中获得１５％的表达,表达产物为２１ＫＤ的蛋白质,经包涵体洗涤,尿素变性和复性后,取１ｉｎｇ表达产物,植入小鼠股四头肌中,２１天后取植入区进行组织切片观察,证实这种基因工程产物具有良好的异位骨诱导活性。     

人骨形成蛋白3在昆虫杆状病毒表达系统中的表达、纯化及其诱骨活性检测

为了在昆虫杆状病毒系统中表达人骨形成蛋白 3(humanbonemorphogeneticproteoin3,hBMP3) ,检测表达产物的诱骨活性 .将hBMP3全长cDNA 1416bp克隆入转移载体K8中 ,再与病毒DNA经脂质体包裹后转染昆虫细胞Sf9.重组病毒经蓝白筛选后 ,用PCR方法扩增目的基因片段进行初步鉴定 .收集重组病毒的转染上清 ,肝素亲和层析纯化目的蛋白 .SDS PAGE和Western印迹进一步鉴定此蛋白 .体外培养MC3T3 E1细胞 ,经目的蛋白刺激后 ,检测细胞内碱性磷酸酶 (ALP)活性 .并将目的蛋白进行小鼠体内肌肉包埋实验 ,检测其异位诱骨活性 .结果显示 ,肝素亲和层析可以收集 1个高的洗脱峰 .SDS PAGE显示 ,非还原型样本为 32kD的二聚体蛋白带和少量 16kD单体蛋白带 ;还原型样本仅有相应大小的单体蛋白带 ,纯度达 80 % .Western印迹在相应位置呈阳性染色 .此蛋白刺激小鼠成纤维细胞 4 8h后 ,胞内ALP的活性增高 ,经rhBMP3作用后的细胞MTT染色减弱 .在小鼠股部肌肉内包埋蛋白样品 2～ 3周 ,组织学检测有成骨组织生成 .说明hBMP3在此套系统中获得了表达 .表达产物在体外可以刺激成骨细胞的分化 ,却抑制细胞的增殖 .小鼠体内异位诱骨实验进一步证实表达产物具有成骨活性     

重组环状胸腺五肽结构类似物Cyclo-（Cys- Arg-Lys –Asp-Val-Tyr）的制备、鉴定和活性检测

为了实现蛋白内含肽(Intein)介导的重组环状胸腺五肽结构类似物［cyclo-（Cys -Arg-Lys –Asp-Val-Tyr）,cTP］的高效制备,设计并合成编码6个氨基酸的cTP基因,克隆到表达载体pTWIN1,重组表达质粒pTW-cTp转化E.coli ER2566构建工程菌,IPTG诱导由几丁质结合域纯化标签（chitin binding domain,CBD）、2个蛋白内含肽和目的多肽组成的“多元”融合蛋白(CBD-intein1-cTP-intein2-CBD)的高效表达.几丁质柱亲合层析纯化融合蛋白后,改变pH值和温度诱导intein1 C端切割,硫醇MESNA诱导intein2 N端切割,释放N端为Cys,C端为硫酯的重组cTP线性前体,通过非保护多肽硫酯环合法实现环肽生成.激光飞行质谱结果显示,纯化产物的分子量为764.4,与环肽的理论值相符.免疫活性检测结果显示,环肽cTP较线性多肽TP-5具有更显著的促进巨噬细胞吞噬能力的活性（P<0.01）和促进B细胞抗体生成的活性（P<0.01）.     

骨形成蛋白10成熟肽在大肠杆菌中的表达纯化及活性分析

目的:以生物制备骨形成蛋白10(BMP10)为目标,研究BMP10成熟肽在大肠杆菌中的表达及活性。方法:以人源BMP10成熟肽基因为模板,PCR获得N端带有组氨酸标签(6×His)的融合基因6×His-m BMP10,构建p ET28a/m BMP10表达载体;热击转染大肠杆菌BL21(DE3)菌株,卡那霉素抗性筛选获得重组表达菌株BL21/p ET28a-6×His-m BMP10,IPTG诱导表达后利用SDS-PAGE电泳、Western印迹对蛋白进行分析;超声波破碎菌体,收集包涵体,镍柱亲和层析纯化获得电泳纯目的蛋白;透析复性后,非还原SDS-PAGE检验目标蛋白的二聚体形成;通过体外细胞实验检测蛋白活性。结果:纯化得到纯度90%以上的m BMP10,复性后二聚体得率约为40%;活性实验测得P19细胞的Smad6蛋白表达上调3倍左右。结论:通过大肠杆菌表达体系获得具有生物活性的BMP10,为后续作用机理研究奠定了实验基础。     

凋亡抑制因子Survivin在大肠杆菌TB1中的表达纯化及鉴定

 本文旨在克隆凋亡抑制因子Survivin基因,并在大肠杆菌中进行可溶性表达与初步纯化. 采用RT-PCR法,扩增人凋亡抑制因子survivin cDNA,并克隆入原核表达载体pMAL p2X中,转化TB1大肠杆菌感受态细胞.经0.3 mmol/L IPTG诱导2 h后,收集菌体蛋白,进行SDS-PAGE、ELISA及Western 印迹鉴定. 实验获得凋亡抑制因子survivin编码区cDNA,以构建的原核表达载体pMAL-p2X survivin转化菌株后,可表达凋亡抑制因子survivin和麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白,相对分子质量(Mr) 为58 000.并成功利用Factor Xa将融合蛋白裂解开.ELISA和Western 印迹表明,融合蛋白能与抗凋亡抑制因子survivin单克隆抗体特异性结合.获得的凋亡抑制因子survivin全长cDNA可在大肠杆菌TB1中以MBP survivin融合蛋白的形式表达,成功地将survivin目的蛋白和MBP蛋白分离,为深入研究survivin的结构和功能奠定了基础.     

重组人骨形态发生蛋白－2成熟肽在大肠杆菌中的表达及其诱导成骨活性

报告了人骨形态发生蛋白－２（ＢＭＰ－２）成熟肽的基因克隆,及其在大肠杆菌中的表达。用ＡｆｌⅡ酶剪除ＢＭＰ－２ｃＤＮＡ中的信号肽及前肽部分的序列,将编码成熟肽的ｃＤＮＡ３′端０．３６ｋｂ基因片段克隆于大肠杆菌表达载体ｐＭＸ－１质粒的ＡＴＧ下游,受控于ＰＬＰＲ启动子。重组子以大肠杆菌ＤＨ５α为宿主细胞进行温度诱导表达。工程菌经４２℃６ｈ诱导后,在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现一条新蛋白带,分子量约为１２ｋＤ,约占菌体总蛋白的２０％。主要以包涵体形式存在的表达产物经初步纯化后,可获得纯度较高的重组人骨形态发生蛋白－２成熟肽（ｒｈＢＭＰ－２ｍ）。小鼠肌肉植入试验发现。ｒｈＢＭＰ－２ｍ植入后的不同时间,在局部出现间质细胞的聚集和增生、软骨细胞及软骨基质的生成和硬质骨的形成,证明ｒｈＢＭＰ－２ｍ具有明显的诱导新骨形成的作用。     

三叶因子Bm-TFF2突变体在原核体系中的表达及促细胞迁移活性

大蹼铃蟾三叶因子Bm-TFF2具有较人TFF2更强的促细胞迁移和抗凋亡活性。该研究利用RT-PCR方法扩增得到野生型Bm-TFF2的基因,然后分别构建N端、C端和分子中两个精氨酸突变的突变体,最后连接表达载体产生pET32a(+)/Bm-TFF2突变型重组质粒,转入大肠杆菌中,经37℃培养,IPTG诱导,其融合蛋白主要存在于包涵体中,用组氨酸标签的亲合柱纯化溶解后的包涵体上清,进一步用RP-HPLC纯化得到硫氧还蛋白(TRX)/Bm-TFF2突变型融合蛋白。通过SDS-PAGE和Westernblotting检测分析其纯度和特异性。最终,从1L培养基中得到20mg纯度为95%的三种重组突变型融合蛋白。三种突变型重组蛋白都具有剂量依赖性的促细胞迁移活性,并且其活性无显著差异。该研究为进一步研究Bm-TFF2结构和功能的关系以及揭示其作用的分子机制奠定了基础。     

东亚钳蝎K+通道阻断肽cDNA的克隆与表达

目的：克隆东亚钳蝎毒素基因,以进一步研究其生物学和药理学功能。方法：利用已知蝎神经毒素基因序列,设计引物,用RT-PCR方法克隆从蝎毒腺组织蝎毒素cDNA。结果：成功地克隆了一个新的东亚钳蝎毒素基因,该基因开放阅读框架编码59个氨基酸残基,其中前22个为信号肽,成熟肽为37个氨基酸残基,经PCR扩增除去信号肽序列,克隆到pTreHisA质粒中,在E．coli中表达了分子质量为7ku左右融合蛋白,表达产物占菌体总蛋白的21％左右。结论：其结构中含有三对二硫链,6个Cys残基组成蝎K^ 通道毒素共同特征序列-CXXXC-、-GXC-、-CXC-,推断其为K^ 通道阻断肽,命名为KChTX1。已被Gene-bank收录,收录号为AY129234。     

弗氏链霉菌丝氨酸蛋白酶基因的克隆及表达

从一株具有极强的降解羽毛能力的弗氏链霉菌菌株（Streptomyces fradiae var.k11）中纯化得到了一种丝氨酸蛋白酶SFP2。经蛋白测序,得到部分氨基酸序列,设计简并引物,PCR扩增得到部分基因序列,通过构建基因文库,获得了包括信号肽序列在内的完整的基因sfp2(EMBL收录号AJ784940),开放阅读框全长924bp,包括114bp的信号肽编码序列和810bp的酶原编码序列, 其中成熟蛋白编码基因长576bp,编码191个氨基酸,理论分子量为19.112kD。酶原编码基因和成熟蛋白编码基因均在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中得到了表达,酶原编码基因表达产物具有正常的生物学活性,证明了克隆基因的生物学功能。     

鸡β-防御素7在大肠杆菌中的表达及活性分析

【目的】根据鸡β-防御素7(Gal-7)的成熟肽基因序列合成基因,构建表达Gal-7的大肠杆菌工程菌,研究重组鸡防御素Gal-7成熟肽的体外生物活性。【方法】将合成的gal-7基因克隆到大肠杆菌表达载体pGEX-6p-1中,得到重组质粒pGEX-6p-gal7,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达得到含GST标签的融合蛋白GST-Gal7;之后用Prescission蛋白酶将GST标签切除,并对成熟肽进行质谱分析;再利用琼脂打孔扩散法检测Gal-7成熟肽的体外抑菌活性,用2倍稀释法测定对指示菌的最低抑菌浓度。【结果】成功构建Gal-7大肠杆菌异源表达工程菌,表达纯化的重组Gal-7成熟肽质谱鉴定分子量为5 516 Da,其对黄色微球菌(NCIB 8166)、金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、粪肠球菌(ATCC 29212)、大肠杆菌(CMCC 44102)均有抑菌活性,最低抑菌浓度分别为16.875、67.5、67.5、135 mg/L。【结论】获得表达鸡Gal-7成熟肽的大肠杆菌工程菌,并且切除GST标签的Gal-7成熟肽具有生物活性。     

中华眼镜蛇短链神经毒素cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达

利用RT－PCR技术从中华眼镜蛇毒腺组织中成功地克隆了短链神经毒素CDNA。测序结果表明,该基因开放阅读框架编码83个氨基酸残基,其中对个为信号肽,成熟肽为62个氨基酸残基。该基因与GenBank报道的相同物种的神经毒素基因有相当的同源性,不同物种之间的信号肽序列十分保守。将短链神经毒素CDNA再经PCR扩增除去信号肽序列,克隆到pT7ZZ表达质粒中,转化E.coliBL21（DE3）后,经IPTG诱导可高效表达分子量为23kDa②左右的融合蛋白。表达产物占菌体总蛋白的25％左右。     

人白细胞介素1受体拮抗剂cDNA克隆及其表达影响因素

采用ＰＣＲ技术成功地从人胎盘ｃＤＮＡ文库中扩增出人白细胞介素１受体拮抗剂（ｈＩＬ １ｒａ）成熟蛋白编码区基因,并以此为模板突变其ｃＤＮＡ５;其克隆产物经物理图谱证实与文献报道完全一致,利用含不同ＳＤ的同一表达质粒分别表达含不同５的ｃＤＮＡ,结合文献分析其表达影响因素,同时对ｈＩＬ １ｒａＥ．ｃｏｌｉ表达产物的可能存在形式进行了推论。     

The amino acidic substitution of cysteine 167 by serine (C167S) in BstVI restriction endonuclease of Bacillus stearothermophilus V affects its conformation and thermostability.

The restriction endonuclease BstVI from Bacillus stearothermophilus V contains three cysteine residues at positions 134, 167 and 180. Titration of Cys residues with DTNB showed that none of them are involved in disulphide bond formation. Cysteine triplets 134 and 167 were modified by recombinant PCR to introduce a serine residue in each case. The mutated genes were cloned into pGEM-T vector and transformed into E. coli JM109. Even though pGEM-T is not designed for expression, the mutant proteins were efficiently expressed in E. coli. The endonuclease carrying the mutation C134S was purified to homogeneity but appeared to be very unstable. In contrast, the C167S mutant enzyme was stable when pure and was studied biochemically. This mutant enzyme was as stable and resistant to protein-denaturing agents as the wild type enzyme. The activity of both enzymes was not affected by preincubations of 2 h at 80 degrees C. A short preincubation at 95 degrees C caused a complete inactivation of the mutant enzyme while the wild type endonuclease retained 30% of its activity. Moreover, the C167S BstVI was more susceptible to be hydrolyzed by proteinase K and trypsine compared to the wild type endonuclease. These results show that the substitution Cys --> Ser at position 167 affects the configuration and thermostability of BstVI restriction endonuclease.