双效表达载体的构建及其U6启动子的功能效率鉴定

利用pBudcE4.1双表达载体构建shRNA与蛋白共表达载体,为双效疫苗的研制提供新的研究思路.以含U6启动子的载体为模板,PCR扩增得到U6启动子,用其置换载体pBudcE4.1内的CMV启动子的核心部分构建shRNA与蛋白共表达载体.用干扰绿色荧光蛋白表达的方法鉴定重组载体中的U6启动子能否启动shRNA的表达.经PCR扩增、双酶切鉴定及DNA测序证明成功构建了载体pBudcE4.1-U6.用干扰载体pBudcE4.1-U6-eGFPshRNA与含eGFP的载体共转染293T细胞后,荧光显微镜观察显示eGFP的表达量下降;流式细胞仪检测细胞的转染效率降低.研究结果证明U6启动子正常发挥作用. 成功构建RNAi与蛋白共表达载体,为利用该载体研制动物双效疫苗奠定了基础.     

口蹄疫病毒外源序列插入位点的研究进展

伴随着对口蹄疫病毒(FMDV)蛋白结构功能的深入研究,发现FMDV能够表达外源基因片段。通过对FMDV的基因进行改造和修饰研究,进而实现了不同应用目的,如提高病毒滴度、引入标记、提高免疫应答、降低致病性等。文中主要从FMDV接受外源基因插入位点角度来介绍现阶段关于FMDV表达外源基因相关进展。     

天门冬多糖对人工感染鸡传染性支气管炎的治疗试验

旨在评价复方天门冬多糖注射液对鸡传染性支气管炎的临床治疗效果,为鸡传染性支气管炎临床治疗提供依据。以复方天门冬多糖注射液临床给药剂量筛选试验为基础,分别设置高剂量组、中剂量组、低剂量组、药物对照组、阳性对照组及空白对照组,运用t检验和方差分析法对攻毒前后试验动物的相对体质量及试验结束后免疫器官指数进行统计分析,通过比较各组数据的显著性差异来评价复方天门冬多糖注射液对鸡传染性支气管炎的治疗效果。结果显示,复方天门冬多糖注射液能提高发病鸡的相对增量率,并促进发病鸡的生长发育。说明,复方天门冬多糖注射液对患病鸡的临床治疗效果显著,在实际生产中可以推广应用。     

弓形虫膜表面抗原SAG2蛋白的高效表达及免疫活性分析

在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达弓形虫膜表面抗原SAG2蛋白,并对其免疫活性进行分析。应用PCR技术从刚地弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码SAG2的基因片段,亚克隆至原核表达载体pET32a(+),在大肠埃希菌(E.coli)BL21内表达,并对其表达条件进行优化,Western blotting和ELISA分析纯化蛋白的免疫原性;纯化的重组蛋白免疫小鼠制备多抗,用间接免疫荧光试验(IFA)分析表达蛋白的免疫反应性。成功构建重组质粒pET32a(+)-tSAG2,所表达的融合蛋白大小约为38kD。在IPTG终浓度为0.1mmol/L、诱导时间4-6h和培养温度32℃条件下,重组SAG2蛋白主要以可溶性形式在大肠杆菌中高效表达,每升培养菌液约获得可溶性重组SAG2蛋白16mg。Western blotting及ELISA结果显示纯化蛋白具有良好的免疫原性。IFA显示重组蛋白的抗血清能够识别刚地弓形虫表面的SAG2天然蛋白,所表达蛋白具有良好的免疫反应性。截断的SAG2基因在大肠杆菌中得到了高效表达,重组蛋白保持了天然蛋白的免疫活性,为进一步利用该重组蛋白进行弓形虫病免疫诊断及基因工程亚单位疫苗的研制奠定基础。     

Asia 1型口蹄疫病毒抗原表位突变株的构建及其生物学特性分析

为了研制口蹄疫抗原表位突变标记疫苗,本研究以含有Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)c DNA全长的感染性克隆p Asia 1-FMDV作为骨架,将3D蛋白中第27位氨基酸的H和31位的氨基酸N分别突变成Y和R,从而突变3D蛋白的一个抗原表位,将构建的带有突变表位的重组质粒转染BHK-21细胞,成功拯救出一株突变FMDV。经比较后发现,重组病毒的生物学特性与亲本毒株相似。病毒中和试验结果显示,抗重组病毒的血清与亲本病毒有良好的反应性。Western blotting结果表明重组病毒诱导的抗体能与突变的表位合成肽反应而不与野生型病毒的表位合成肽发生反应,从而区分重组病毒与亲本病毒。综上所述,这株抗原表位突变FMDV有望作为口蹄疫标记疫苗候株进一步评估。     

产后子宫内膜炎与围生期解脲脲原体感染有关

为了探讨围生期支原体感染与产后子宫内膜炎的关系及治疗,本研究选取产后子宫内膜炎患者73例作为观察组,同时选取正常产妇80例作为对照组。通过检测两组解脲脲原体(Uu)和人型支原体(Mh)感染情况,同时给予观察组常规治疗,本研究发现观察组Uu阳性比例为32.88%,明显高于对照组(p<0.05);观察组和对照组Mh阳性差异比较无统计学意义(p>0.05);观察组Uu阳性和Mh阳性产妇发生早产或胎膜早破的比例分别为62.50%和25.00%,明显高于支原体感染阴性产妇(p<0.05);观察组Uu阳性、Mh阳性和阴性患者治疗效果比较差异无统计学意义(p>0.05);观察组治疗后Uu阳性率为10.96%,明显较治疗前降低(p<0.05);观察组治疗前后Mh阳性率比较差异不显著(p>0.05)。本研究表明,Uu感染与产后子宫内膜炎发生有一定关系,围生期应加强Uu感染筛查,并及时进行治疗。     

黄芪多糖对Lewis肺癌小鼠细胞因子及顺铂所致免疫功能低下的影响

目的观察黄芪多糖(APS)对小鼠Lewis肺癌移植瘤生长、细胞因子及顺铂(DDP)所致免疫功能低下的影响。方法 90只小鼠,设空白对照组10只,余80只依次造模为荷瘤小鼠,并随机分为8组:模型组(等体积生理盐水),顺铂阳性对照组(6 mg/kg DDP),APS低(50 mg/kg)、中(100 mg/kg)、高剂量(200 mg/kg)组,联合用药低、中、高剂量组(DDP剂量减半,APS各剂量同上),于造模次日起各组分别腹腔注射等体积的药物0.3 mL。DDP每周一次,其余药物每天1次,连续20d。于第21天取血清采用ELISA法测定细胞因子IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α的水平,并观察各组抑瘤率及免疫器官指数。结果 DDP、APS低、中、高剂量及联合用药低、中、高剂量组对小鼠Lewis肺癌移植瘤的抑瘤率分别为49.30%、17.21%、39.68%、42.98%、51.02%、57.21%、65.11%(与模型组比较P0.05或0.01;联合用药组与DDP组比较P0.05)。与空白对照组比较,APS中、高剂量组和联合用药组脾脏指数显著升高;与模型组比较,APS高剂量和联合高剂量脾脏指数差异有显著性(P0.05);与DDP组比较,APS各剂量和联合用药组小鼠胸腺指数和脾脏指数均升高。结论 APS能提高Lewis肺癌小鼠血清中细胞因子IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α的水平;增强DDP所致免疫功能低下小鼠的免疫功能,对免疫器官有一定的保护作用;能抑制小鼠Lewis肺癌细胞的生长,在与DDP减半量联合使用时可使DDP抑瘤作用增强,且其机制可能与增强机体的免疫功能有关,说明APS对DDP有一定的增效减毒作用。此项研究在实体瘤的治疗中有潜在的应用前景。     

猪源冠状病毒聚合酶基因的克隆及特性分析

参照GenBank中Purdue株序列对TGEV TS株聚合酶基因(ORF1)设计特异性引物,经RT-PCR扩增获得了20054bp的片段,与预期大小相符.TS株与Pur46-MAD株的ORF1核苷酸和氨基酸序列同源性分别为98.8%和99.0%,与FIPV、PEDV、HCV299E及SARS氨基酸同源性分别为88%、57%、57%和45%.不同冠状病毒比较结果显示RdRp有很高的保守性而且有重要的作用,序列分析标明TS株在ORF1a和ORF1b重叠区有核糖体剪切位点UUUAAAC,且相应区域RNA二级结构形成3个茎环结构.     

进口奶牛犬新孢子虫病血清学抗体及流产胎儿病原分子生物学检测

采用间接免疫荧光抗体试验对随机抽取的3批进口奶牛1 238份奶牛血样进行牛新孢子虫病的流行病调查.随后用乳胶凝集对牛新孢子虫抗体阳性样品进行弓形虫抗体检测.并用已建立的牛新孢子虫病巢式PCR(Nested-PCR)对第一批进口奶牛的数十头流产胎儿进行牛新孢子虫病的病原分子生物学检测.结果表明,3批进口奶牛的新孢子虫整体感染率为6.54%,所有奶牛犬新孢子虫抗体阳性血清的弓形虫抗体全部为阴性.新孢子虫血清抗体阳性母牛流产的胎儿经Nested-PCR检测,60%胎儿为阳性,而抗体阴性母牛流产的胎儿经Nested-PCR检测均为阴性.     

猪戊型肝炎病毒swCH-GS189株ORF2基因的克隆及序列分析

为进行猪戊型肝炎病毒(HEV)ORF2基因特征研究,参照GenBank中已发表的戊型肝炎病毒(HEV)核酸序列,设计了一对扩增HEV ORF2基因的引物,利用RT-PCR等方法克隆出了一株猪戊型肝炎病毒甘肃分离株GS189的ORF2基因cDNA片段.序列测定结果表明,swCH-GS189株的ORF2基因长2 025 bp,编码674个氨基酸,与GenBank中公布的其它毒株间的核苷酸序列同源性为79.1%～91.8%,推导的氨基酸序列同源性为89.5%～98.8%.系统发育进化树结果表明,该分离株为基因IV型.