单纯疱疹病毒通用及Ⅱ型特异性DNA探针的制备及应用研究

单纯疱疹病毒（ＨＳＶ）Ⅰ型及Ⅱ型之间有很多共同抗原,能引起血清学交叉反应,鉴别诊断比较困难。本实验利用重组ＤＮＡ技术,将部分ＨＳＶ－２ＤＮＡ的ＰｓｔＩ片段克隆到载体质粒ＰＳＫ中,并筛选出两个重组质粒（Ｐ和Ｐ）只与ＨＳＶ－２反应,与ＨＳＶ－１不反应,这两个重组质粒中所含的ＨＳＶ－２ＤＮＡ片段大小分别是３．１和４．３ｋｂ,另外,还筛选了一个重组质粒（ＰＨＳＶ２－１,含５．８ｋｂＨＳＶ－２ＤＮＡ片段）与ＨＳＶ－１和ＨＳＶ－２均反应。将４．３ｋｂ的片段用光生物素标记后作为探针检测了１５９份人阴道拭子,其中２３份样品呈阳性反应,其余均为阴性,从２３份阳性样品中挑选１２价涂片用间接荧光抗体法检测也都呈阳性反应,随机挑选的几份杂交反应阴性样品在间接荧光试验中也是阴性。本实验制备的ＨＳＶ通用及ＨＳＶ－２型特异性探针将比常规的血清学方法诊断和鉴别ＨＳＶ－１和ＨＳＶ－２感染更为可靠。     

抗菌肽在宿主防御中作用

抗菌肽广泛地存在于自然界中,其中许多抗菌肽具有直接抗微生物活性,能作用于G-、 G+细菌、真菌、寄生虫甚至是包膜病毒,并且在宿主先天免疫和适应性反应中有重要的调节作用。近来,越来越多的证据表明抗菌肽是有效的免疫辅助因子,能够与其他的众多免疫效应子协同作用,从而起始适应性免疫,促进伤口愈合,抑制前炎症反应以及诱导和调节细胞因子和趋化因子的产生。另外,随着抗菌肽作用机理逐渐被揭开,将这些内源性肽及其衍生物制成抗感染治疗药剂将会有广阔的应用前景。     

抗禽流感病毒多表位DNA疫苗的构建及其免疫效力研究

多表位DNA疫苗是建立在常规DNA疫苗基础上的一种新型疫苗。它是用表位作免疫原,这样就比较容易在一个表达载体上克隆病原体的多个抗原基因中具有免疫活性的部分。本试验以H5N1亚型禽流感病毒的HA和NP基因及其表位为基础构建了4个重组质粒：1 pIRES/HA（表达全长的HA基因）;2 pIRES/tHA（只表达HA基因的主要抗原表位区）;3 pIRES/tHANpep（融合表达HA基因的抗原表位区和NP基因的3个CTL表位）;4 pIRES/tHANpep-IFN-γ（用鸡的IFN-γ基因取代质粒pIRES/tHANpep中的neo基因）。分别用这4个重组质粒和空载体质粒pIRES1neo肌注免疫30日龄SPF鸡。免疫3次,间隔为2周,每次每只鸡的剂量为200μg。第3次免疫后两周以高致病性禽流感病毒H5N1强毒攻击,免疫及攻毒前后均采血检测HI抗体效价和外周血CD4⁺、CD8⁺T细胞的变化。结果发现,攻毒前各质粒免疫组均检测不到HI抗体,攻毒后1周存活鸡HI抗体效价迅速升高到64～256。流式细胞仪检测显示外周血CD4⁺、CD8⁺T细胞在疫苗免疫后都有不同程度的升高。空载体质粒对照组鸡（10只）在攻毒后3～8 d内全部死亡,其他各重组质粒免疫组鸡都获得了部分保护,保护率分别是：pIRES/HA组为545%（6/11）,pIRES/tHA组为30%（3/10）,pIRES/tHANPep组为36.3%（4/11）, pIRES/tHANPepIFNγ组为50%（5/10）。这些结果表明我们构建的多表位DNA疫苗能够诱导机体产生特异性免疫应答,并在同型禽流感强毒攻击时对鸡只提供了一定的保护。     

表达O型口蹄疫病毒VPl基因的重组病毒BHV-1的构建与鉴定

[目的]为了构建表达口蹄疫病毒(O/china/99)VP1基因的牛疱疹病毒1型,将人工合成的口蹄疫病毒VP1基因插入到巨细胞病毒(CMV)启动子之下构建gE基因缺失转移载体.[方法]利用磷酸钙介导转染法将该转移载体与亲本病毒BHV-1/gE-/LacZ+的基因组DNA共转染牛鼻甲细胞后收获增殖的病毒.通过筛选白色病毒蚀斑,得到重组病毒BHV-1/gE-/VP1.[结果]PCR检测结果表明VP1基因已经插入到了重组病毒BHV-1/gE-的基因组中,间接免疫荧光试验和Westem blot证实了BHV-1/gE-/VP1中的VP1基因在感染的细胞中获得了表达.[结论]本研究成功地构建了表达口蹄疫病毒VP1基因的重组病毒BHV-1/gE-/VP1,为研制口蹄疫及其他重要牛传染病的BHV-1病毒载体疫苗奠定了基础.     

猪传染性胃肠炎病毒n基因的原核表达及重组蛋白的免疫活性分析

猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gas-troenteritis virus,TGEV)引起的一种急性、高度接触性传染病,以呕吐、水样腹泻、脱水和对2周龄以内仔猪高度致死率为特征[1]。猪传染性胃肠炎病毒隶属于冠状病毒科冠状病毒属,是引起仔猪病毒性腹泻的重要病原,其基因组为单股正链的有感染性不分节段的RNA,TGEV结构蛋白主要由S、N、Ms、M蛋白组成[2]。其中n基因指导合成病毒的核衣壳蛋白(N),它是一种磷酸化的蛋白,存在于病毒粒子的内部,其分子质量为47kD[3],与病毒基因组组成核衣壳;N…     

猪生殖-呼吸道综合征病毒(PRRSV)CH-la株糖蛋白基因的遗传变异分析

新近发现的猪生殖-呼吸道综合征病毒(PRRSV)是单股RNA病毒,属于不久前成立的动脉炎病毒科.为了比较国内分离的CH-la株与国外毒株的分子遗传学关系,扩增并克隆了PRRSV CH-la株糖蛋白基因ORF2～5,测定了其核苷酸序列.用序列分析软件分析了其编码产物的分子量、等电点、疏水性、抗原性和有关位点,并与国外毒株进行了序列比较和系统发育进化分析.结果表明:CH-la株与VR-2332株尽管密切相关,但二者之间也有较大的变异,且ORF3和ORF4重叠区存在一个高变区.这提示CH-la株和VR-2332株可能是北美洲型中的两个不同亚型.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF2～4特异siRNA的筛选及其抑制病毒复制效果的研究

RNA干扰(RNAi)技术是基因功能研究的有效工具,为了了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)次要结构蛋白GP2、GP3、GP4在病毒复制中的作用,针对各自的编码基因ORF2、ORF3、ORF4分别选取4个小干扰RNA(siRNA)位点(共12个),构建相应的短发夹RNA(shRNA)表达载体,转染MARC-145细胞后,通过荧光定量PCR和病毒滴度检测干扰效果。筛选了可以减少GP2、GP3、GP4相应基因mRNA含量的ORF2、ORF3、ORF4特异shRNA表达载体,病毒效价滴定表明shRNA表达载体处理细胞可以减少GP2、GP3、GP4相应基因mRNA含量,细胞培养上清中的病毒滴度比对照低184~4.65倍。     

犬Ⅰ型腺病毒DNA的酶切分析及分子克隆

犬Ⅰ型腺病毒(CAV-1)弱毒用限制性内切酶EcoR Ⅰ,BamH Ⅰ,Pst Ⅰ,Sph Ⅰ和Hind Ⅲ消化分析后其图谱与强毒株相比没有差异。将弱毒DNA用Pst Ⅰ完全消化后以鸟枪法克隆到载体质粒pBluescrip'SK中,经用光生物素标记的CAV-1 DNA杂交筛选以及Pst Ⅰ分析重组质粒证明已将分子量为5.5,3.5,2.85,1.2,0.32和0.28Kb的CAV-1DNA片段克隆到质粒中。克隆到的这些片段将可考虑进一步研究作为探针检测犬及狐狸等野生动物的腺病毒感染。     

表达O型口蹄疫病毒保护性抗原表位重组PRRSV的构建及其鉴定

以高致病性猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗的感染性分子克隆(rHuN4-F112)作为载体,将O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因的421~480nt(141~160aa)和598~639nt(200~213aa)两优势保护性抗原表位串联成的目的基因,通过突变PCR的方法插入Nsp2中的508~532位缺失区域,经体外转录后转染至BHK-21细胞中培养36 h,将上清接种至MARC-145细胞中培养,并在MARC-145细胞中连续传代,拯救重组病毒。经RT-PCR扩增,MluⅠ酶切及测序验证,结果表明插入的外源基因及人为突变的MluⅠ分子标记都正确,说明重组病毒拯救成功,且该重组病毒能够在MARC-145细胞中稳定传代,将此重组病毒命名为rPRRSV-F112-O/VP1ep。rPRRSV-F112-O/VP1ep能够在MARC-145细胞上引起明显的细胞病变,间接免疫荧光检测表明外源基因在该病毒中成功获得了表达。经过生物学特性分析,该病毒的TCID50=-log10-6.75/0.1 mL,且在MARC-145细胞中整体生长速度与其亲本病毒rHuN4-F112(△508-532)相似,但明显高于rHuN4-F112病毒。