治疗型VP22△-mE6△/mE7重组蛋白疫苗的表达与免疫学初步分析

制备16型人乳头瘤病毒mE6Δ/mE7蛋白与I型人单纯疱疹病毒VP22Δ蛋白的治疗型分子内佐剂融合蛋白疫苗,并检测其免疫原性和抗肿瘤相关生物活性。通过克隆HSV-1 VP22Δ及HPV-16 mE6Δ/mE7基因,构建pET28a-VP22Δ-mE6Δ/mE7原核表达载体。重组质粒在Rosetta（DE3）宿主菌中进行诱导表达,表达蛋白经分离、复性后,通过镍离子亲和层析进行纯化,纯化蛋白经SDS-PAGE、Western blot 鉴定,并免疫BalB/C及C57BL/6小鼠,检测其免疫原性和抗肿瘤活性。结果显示,VP22Δ-mE6Δ/mE7蛋白以包涵体形式表达,分子量约为34kDa,表达量约占菌体总蛋白的45%。该蛋白免疫小鼠后血清特异性IgG、特异性淋巴细胞增殖效果及对TC-1致瘤小鼠的肿瘤治疗效果均高于无佐剂单一重组蛋白疫苗。以上结果说明,所获得的重组融合蛋白具有较好的免疫原性和抗肿瘤活性,为治疗型HPV分子内佐剂疫苗的进一步研究奠定了基础。     

小肠三叶因子在乳酸菌中的表达

实验目的是在乳酸菌中表达小肠三叶因子(ITF) ,并建立兔子胃溃疡模型,口服观察ITF对胃黏膜损伤的再生作用。在实验中利用了分子克隆技术构建携带ITF基因的重组原核表达质粒 pNICE:sec ITF,将重组质粒转化乳酸菌 NZ9000株 ,筛选鉴定阳性菌落,用nisin诱导表达,表达ITF蛋白通过Tricine SDS-PAGE和 Western blot进行鉴定。将重约2㎏的新西兰成年兔分为对照组,预防组,治疗组,用盐酸诱导胃溃疡模型,预防组在模型建立前用携带 pNICE:sec-ITF的乳酸菌灌胃,对照组,治疗组,在溃疡模型建立后,分别用 PBS、携带pNICE:sec-ITF的乳酸菌灌胃。通过溃疡级别及损伤指数的确定携带 pNICE:sec-ITF的乳酸菌灌胃后对胃黏膜损伤再生的作用。实验成功扩增ITF基因并构建了重组原核表达质粒 pNICE:sec-ITF,转化乳酸菌 NZ9000后经 nisin诱导可表达 Mr约 6.0kDa的重组蛋白 ,表达量约占菌体总蛋白量的 5%。动物实验的预防组和治疗组显示在盐酸诱导胃溃疡模型前和后用携带pNICE:sec-ITF的乳酸菌灌胃,能够促进溃疡黏膜的再生。这对新型的基因工程药物的研究开发具有一定的理论意义,为乳酸菌作为药物递送载体的研究和开发打下一定的实验基础。     

树鼩γ干扰素在大肠杆菌中的表达、纯化及免疫原性鉴定

目的:克隆树鼩γ干扰素(IFNγ)基因,在大肠杆菌中高效表达纯化并鉴定其免疫原性。方法:提取树鼩肺组织总RNA,经RT-PCR扩增出树鼩IFNγ基因,再克隆到原核表达载体p ET30a(+),构建重组表达质粒p ET-30a(+)-IFNγ,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达树鼩IFNγ;经金属螯合柱复性及纯化,Western印迹和ELISA检测其免疫原性,并检测不同组织中IFNγ的分布情况。结果:构建了重组表达质粒p ET-30a(+)-IFNγ,重组蛋白在30℃、1 mmol/L IPTG诱导4 h获得较高表达量,镍柱复性纯化后得到较高纯度的树鼩IFNγ。Western印迹显示IFNγ可与兔抗人IFNγ单克隆抗体特异性结合,应用Western印迹和ELISA分别检测树鼩IFNγ的免疫原性和抗体滴度,在树鼩的鼻、心、肝、肺、肾、气管中检测到IFNγ。结论:在大肠杆菌中高效表达了重组树鼩IFNγ,复性纯化后具有良好的免疫原性。     

重组肿瘤坏死因子-α衍生物的制备及聚乙二醇修饰

应用搭桥PCR技术,将肿瘤坏死因子-α基因的前4位氨基酸的编码序列删除,对hTNF-α的第8/9/10/29/31/157位氨基酸的密码子进行定点突变,将突变后的cDNA插入到pBV220载体中构建重组质粒pBV220-tnf-αD4。将重组质粒转化大肠杆菌DH5α,筛选获得了高效表达TNF-αD4突变体的工程菌,表达的重组蛋白约占菌体蛋白总量的45%左右,经硫酸铵沉淀和阳离子交换层析纯化得到纯度达90%以上的重组目的蛋白,比活性达到8×107。用单甲氧基聚乙二醇-丁醛（mPEG-ButyrALD）对TNF-αD4进行修饰,经阳离子交换层析纯化得到纯的mPEG-TNF-αD4,纯度达85%以上,比活性达到8.6 ×107,系统毒性也有了明显的降低。此项工作通过应用PEG修饰肿瘤坏死因子-α,为降低其毒性,增加其活性进行了有益的尝试,为其进一步研究与开发奠定了基础。     

一种新型广谱流感病毒亚单位疫苗的表达与纯化

通过引物设计,利用重叠延伸PCR（OE-PCR）和搭桥PCR方法扩增得到A型流感病毒M2蛋白缺失跨膜区基因以及HA多表位基因,分别克隆测序后以pET28a+为表达载体构建重组质粒pET28a+-M2d-HA。将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,筛选获得了高效表达流感病毒缺失跨膜区M2蛋白和HA多表位蛋白片段重组融合蛋白的工程菌,表达的重组蛋白约占菌体总蛋白总量的45%左右。表达的蛋白以包涵体形式存在,包涵体经亲和层析和阴离子交换层析纯化后复性,得到纯度在90%以上的目的蛋白。Western blot结果显示纯化的重组蛋白具有较好的抗原性和特异性。此项工作为进一步研究广谱型流感病毒亚单位疫苗奠定了基础。     

HPV16 L2肽段偶联AP205 VLP的原核表达及免疫原性分析

目的:将编码HPV16衣壳蛋白L2的65～71、112～120免疫优势表位连接到RNA噬菌体衣壳蛋白AP205氮端,组装形成病毒样颗粒,通过在大肠杆菌中实现表达及纯化,对其免疫原性进行研究。方法:合成编码AP205衣壳蛋白基因和HPV16 L2的65～71、112～120位氨基酸表位的基因序列,PCR连接并克隆至pET30a(+)原核表达载体,构建重组表达质粒pET30-AP205-HPV16ΔL2,转化大肠杆菌BL21(DH3)感受态细胞,IPTG诱导表达。表达蛋白经凝胶层析纯化及SDS-PAGE、Western blot等理化性质检测,免疫接种ICR小鼠,通过间接ELISA法检测其免疫原性。结果:成功构建重组表达质粒,重组蛋白在大肠杆菌中以可溶性表达,透射电镜观察可见典型病毒样颗粒,该VLP在动物实验中表现出较好的免疫原性。结论:成功将HPV16 L2表位偶联AP205以形成VLP,在大肠杆菌中实现可溶性表达。