苏云金芽胞杆菌Sigma K在大肠杆菌中的表达与纯化

【目的】在大肠杆菌中表达纯化苏云金芽胞杆菌HD73的转录调控因子Sigma K(σK)。【方法】PCR扩增出苏云金芽胞杆菌HD73中sig K基因的ORF(Open reading frame)装载到带有His标签的表达载体p ET21b上,转入到表达菌株BL21(DE3)中获得重组菌株BL21(p ETsig K),通过SDS-PAGE、镍柱亲和纯化、阴离子交换纯化和凝胶迁移实验(EMSA)等方法对Sigma K蛋白进行提取、纯化和生物活性分析。【结果】正确表达出大小约为27 k D的His-Sigma K蛋白,并获得了纯化的蛋白。EMSA结果表明纯化的His-Sigma K蛋白可以与受其控制的cry1Ac基因启动子结合。【结论】表达和纯化了His-Sigma K蛋白,His-Sigma K具有与受其控制的启动子结合的功能。     

苏云金芽孢杆菌CrylAb13基因的克隆及表达研究

BtC005是我国自行分离的对多种害虫具有毒杀作用的苏云金芽孢杆菌。经PCR-RFLP系统鉴定,它含有crylAb基因。Southern blot结果显示;PstI酶切C005质粒所得的8.5kb长的DNA片段为crylAb基因的阳性杂交带。以pUCP19为载体,克隆了该片段并证明其含有crylAb基因,对其进行亚克隆和测序,结果表明该基因编码区为3468bp,其编码的蛋白含1155个氨基酸,分子量为130.6kD,等电点为pH4.845。该基因已在GenBank基因库中注册,Accession number为AF254640,并为国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为crylAb13。将crylAb13基因在Bt无晶体突变株cryB^-中表达,蛋白质电泳结果表明在130kD处有表达带,并证明GryAb对小菜蛾有较高的杀虫活性。     

对Bt蛋白敏感敏感和敏感的棉铃虫中肠细菌群落的比较

摘要：【目的】通过比较Cry1Ac蛋白抗性及敏感棉铃虫中肠细菌群落的结构组成,研究中肠微生物是否与棉铃虫Bt抗性产生有关。【方法】首先提取了棉铃虫中肠微生物基因组DNA,通过PCR扩增获得了16S rDNA全长片段及V3区。采用基于16S rDNA 的免培养技术—16S rDNA文库建立和变性梯度凝胶电泳（DGGE）研究了国内特有的Bt抗性和敏感品系棉铃虫中肠细菌群落组成,并对其进行分析和比较。【结果】16S rDNA文库测序结果表明,抗性品系与敏感品系棉铃虫中肠细菌群落特别是优势菌群非常相似,但在部分劣势菌群上存在差异。抗性品系中主要优势菌有：不可培养微生物（Uncultured bacterium）占56.4%,鹑鸡肠球菌（Enterococcus gallinarum）占17.0%,铅黄肠球菌（Enterococcus casseliflavus）占17.0%;敏感品系中主要优势菌为不可培养微生物（Uncultured bacterium）60.2%,鹑鸡肠球菌（Enterococcus gallinarum）占19.3%,铅黄肠球菌（Enterococcus casseliflavus）占14.7%。随后进行的PCR验证表明,部分有差异的劣势菌在两种品系虫体都存在。DGGE图谱分析表明,这两个品系棉铃虫中肠菌群相似性达到92.3%。【结论】敏感品系与抗性品系棉铃虫肠道菌群组成极其相似,推测抗性的产生与肠道微生物无直接关系。     

Bt群体信号应答因子nprR基因的缺失对cry1Ac基因表达的影响

摘要：【目的】研究群体信号应答蛋白编码基因nprR在苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）HD-73菌株晶体蛋白形成过程中的作用。【方法】通过同源重组,构建了HD-73 nprR基因缺失突变菌株HD73（ΔnprR ）。利用启动子-lacZ融合、SDS-PAGE方法,测定不同培养基中nprR基因转录活性及nprR基因缺失对cry1Ac转录及表达的影响。【结果】启动子转录活性分析表明,在LB和SSM培养基中nprR基因从对数期结束（T0）开始表达,稳定期持续表达。在LB培养基中,nprR基因的缺失使cry1Ac基因在生长过渡期和稳定期前期转录活性显著提高,同时HD73（ΔnprR ）菌株Cry蛋白生成量也明显高于出发菌株HD-73,但是在芽胞形成释放后,Cry蛋白的表达没有明显的区别。【结论】在丰富培养基中苏云金芽胞杆菌nprR基因的缺失在生长过渡期和稳定期前期能够提高cry1Ac基因转录和表达,从而缩短了cry基因表达时间,并且Cry蛋白总产量与出发菌株相当。     

苏云金芽孢杆菌B-Pr-88菌株中cry2Ab4基因的表达和杀虫活性研究

以我室自行分离的对鳞翅目夜蛾科害虫具有高毒力的Bt菌株B-Pr-88为材料,用PCR-RFLP方法从其质粒DNA文库中筛选到含cry2Ab基因的一个阳性克隆pZF858,序列测定发现,该片段含有cry2Ab全长基因,开放读码框为1902bps,编码由633个氨基酸组成的70.7kD蛋白,氨基酸同源性与已公布的cry2Ab基因同源性均为99.8％,经Bt基因国际命名委员会正式命名为cry2Ab。根据cry2Ab基因开放阅读框架(ORF)两端序列,设计合成一对特异引物L2ab5和L2ab3,PCR扩增获得cry2Ab 完整ORF,与大肠杆菌表达载体pET-21b连接,构建了重组表达质粒pET-2Ab4,质粒导入大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳证实该基因表达了60kD的蛋白,生物测定表明,Cry2Ab4对棉铃虫和大豆食心虫具有高毒力,同时对小菜蛾和二化螟有一定的杀虫活性,而对亚洲玉米螟和甜菜夜蛾没有杀虫活性。     

转录因子cpcR同源基因cpcR-c1和cpcR-t的功能鉴定

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt） LM1212菌株与典型的Bt菌株表型不同,可分化形成芽胞、形成细胞和晶体产生细胞。在LM1212菌株中,转录因子CpcR不仅参与了细胞分化过程,而且能够激活晶体蛋白基因cry35-like的启动子(P₃₅)。【目的】筛选cpcR同源基因,验证其生物学功能。【方法】本研究克隆了2个cpcR同源基因,来源于蜡样芽胞杆菌的cpcR-c1和来源于东洋芽胞杆菌的cpcR-t,将cpcR及其同源基因分别构建在pHT304-P₃₅-gfp、pHT304-P₃₅-lacZ报告载体上,获得的重组质粒转入无cpcR基因且无晶体蛋白基因的Bt HD73^–菌株中。利用激光共聚焦显微镜观察重组菌HD^–(cpcR-c1-P₃₅-gfp)和HD^–(cpcR-t-P₃₅-gfp)的细胞表型并进行芽胞计数实验。测定HD^–(cpcR-c1-P_35<...     

苏云金芽胞杆菌LM1212菌株cry基因启动子的活性分析

【背景】前期发现一株具有独特分化表型的苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)LM1212,该菌株共有14种杀虫基因,组成了10个转录单元。利用源自菌株LM1212的晶体产生细胞调控因子(crystal producing cell regulator, CpcR)以及其可以激活的cry35-like基因启动子,已在典型Bt菌株HD73中成功构建了非芽胞杀虫蛋白表达体系。【目的】比较菌株LM1212的不同杀虫基因启动子的转录活性,明确可被转录因子CpcR激活的且转录活性较高的启动子,以此为基础优化非芽胞杀虫蛋白表达体系。【方法】将10个启动子区域分别与lacZ报告基因融合构建在pHT304-18Z载体上,得到了10个重组质粒;然后将cpcR基因及其启动子(PcpcR-cpcR)分别反向构建在选取的启动子区域与lacZ报告基因的上游,得到可以表达CpcR且与上述构建相对应的10个重组质粒,将这些重组质粒分别转入不含CpcR的菌株HD73,即获得20个可用于测定β-半乳糖苷酶活性的重组菌株。通过光学显微镜观察和SDS-PAGE检测明确杀虫蛋白表达的情况。【结果】在...     

苏云金芽胞杆菌Sigma54和CcpA共同调控的基因鉴定

【目的】通过综合分析苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)HD73菌株Sigma54缺失突变体的转录组数据和蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)ATCC 14579菌株CcpA缺失突变体的转录组数据,并进行启动子与CcpA蛋白的体外结合验证,明确Bt HD73菌株中Sigma54和CcpA共同调控的基因,丰富了对微生物的代谢调控网络的认识。【方法】以转录组测序结果为基础,通过基因同源性的比对在Bt HD73菌株中寻找受Sigma54和CcpA共同调控的基因,在这些基因中找到具有cre序列的启动子,通过凝胶阻滞验证这些启动子与CcpA蛋白的结合。【结果】Bt HD73菌株中有31个基因受Sigma54和CcpA共同调控,其中14个基因的启动子序列包含cre序列,这些启动子都可以与CcpA蛋白发生体外结合。【结论】Bt HD73菌株中有14个基因直接受CcpA的调控,同时其转录受Sigma54的控制。     

yhcZ基因在苏云金芽胞杆菌生长中的功能研究

在枯草芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌中,yhcZ基因和yhcY基因组成双组分系统调控细菌生长,但yhcZ基因在苏云金芽胞杆菌中发挥的生物学功能尚未明确。本研究通过基因功能注释、上下游基因排列分析和氨基酸序列比对,证实苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种HD73中HD73_5824基因为yhcZ基因,推测其与HD73_5825基因(yhcY基因)共同组成双组份系统调控细菌生长。利用同源重组技术敲除HD73菌株中的yhcZ基因获得缺失突变体HD (ΔyhcZ),其在LB和SSM培养基中生长均慢于野生型HD73,而互补菌株HD(ΔyhcZ::yhcZ)菌株则能够部分恢复生长,表明yhcZ基因的缺失影响了该菌株细胞的生长。在以0.4%葡萄糖为唯一碳源的M9培养基中,HD (ΔyhcZ)生长速度快于HD73,表明yhcZ基因在该菌株吸收利用葡萄糖的过程中发挥重要作用。Biolog实验显示HD (ΔyhcZ)的单孔颜色变化率低于HD73,且对D/L-丝氨酸、甲酸、D-葡糖酸、L-组胺,D-乳酸甲酯以及柠檬酸等的吸收利用能力低于HD73,表明yhcZ基因能显著影响HD73菌株对碳源的利用。同时,HD(ΔyhcZ)对8% NaCl的耐受能力弱于HD73,表明该基因可能参与细菌细胞应力响应相关基因的表达与调控。以上结果表明yhcZ基因在HD73菌株生长过程中对葡萄糖及其他碳源的利用具有重要的促进作用。本研究结果为解析yhcZ基因调控葡萄糖及碳源利用的分子机制奠定基础,且为进一步研究细菌生长及发酵提供参考。     

铜绿丽金龟和黄褐丽金龟幼虫感染Bt HBF-1菌株后的病症及中肠组织病理变化

研究了丽金龟科(Rutelidae) 铜绿丽金龟Anomala corpulenta和黄褐丽金龟A. exoleta幼虫感染苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis HBF-1菌株后的病症,并采用组织切片的方法研究了感染HBF-1菌株后中肠的组织病理变化。结果表明： 丽金龟科幼虫感染HBF-1菌株后,初期幼虫无明显感病症状,随着感染时间的延长,逐渐出现反应迟钝、麻痹、丧失条件反射能力等症状,最终虫体变黑、伸直或是收缩,直至死亡,时间稍长便会呈腐稠状。在相差显微镜下观察中肠组织切片发现,感染3 d时,肠壁细胞出现变形及空洞;7 d时,细胞破坏更加严重,甚至无法辨认细胞形状;10 d时,肠壁细胞开始脱离底膜;新鲜死虫,肠壁细胞连同细胞内含物全部脱离,仅留底膜。