Necrostatin-1抑制白色念珠菌诱导的巨噬细胞自噬而影响免疫应答

随着现代医疗技术的发展,人口老龄化加剧,抗生素滥用等降低人体免疫力的因素越来越多,使得由白色念珠菌Candida albicans感染引起的疾病发生率越来越高。本研究通过使用程序性坏死的选择性抑制剂Necrostatin-1,初步探索了细胞自噬和程序性死亡在巨噬细胞抗白色念珠菌感染中的作用。研究表明:细胞自噬参与了白色念珠菌侵染巨噬细胞的过程,而Necrostatin-1可能通过抑制白色念珠菌感染引起的自噬促进IL-6的表达,并抑制TNF-α(肿瘤坏死因子α)的表达,进而对白色念珠菌引起的天然免疫反应产生影响。细胞自噬在抗真菌感染方面的研究已有报道,而程序性坏死在抗真菌感染方面的研究鲜有报道,同时Necrostatin-1在巨噬细胞抗白色念珠菌感染中的作用尚未见报道。本研究对白色念珠菌侵染机理的探索具有一定的意义。     

不同灌水处理下冬小麦地上干生物量的高光谱监测

地上干生物量是反映作物生长发育和产量的重要指标。本试验通过不同的灌溉处理,研究了冬小麦生育期地上干生物量的变化规律,分别利用多元线性回归(MLR)和连续投影算法-MLR(SPA-MLR)构建了冬小麦地上干生物量光谱监测模型。结果表明:拔节期+孕穗期+开花期+灌浆期的灌溉方案有利于生物量积累;基于SPA-MLR构建的预测模型精度均高于MLR预测模型,其中,以开花期模型最优,R~2达到了0.96,RMSE为0.092,验证集的R~2为0.76,RMSE为0.18;综合冬小麦主要生育时期(拔节期至灌浆期)的预测模型的R~2达到了0.64,RMSE为0.30,验证集的R~2为0.54,RMSE为0.26,可以实现拔节期至灌浆期冬小麦地上干生物量的预测。本研究可为利用高光谱遥感技术预测冬小麦地上干生物量提供技术支持。     

重组阳离子抗肿瘤肽AIK的原核表达、纯化及活性测定

利用Gateway克隆技术构建重组抗瘤肽AIK的原核表达体系,建立表达及纯化重组AIK的最优条件,为深入研究和利用AIK奠定基础。首先,设计含AttB重组位点的引物,通过重叠PCR技术扩增出Att B-TEV-FLAG-AIK序列,利用BP重组反应将目的序列TEV-FLAG-AIK克隆到供体载体pDONR223中,构建入门载体,再通过LR重组反应,将目的序列转移到目的载体pDEST15中,构建GST-AIK融合蛋白原核表达质粒。随后,在BL21(DE3)工程菌中优化诱导融合蛋白表达的条件。以谷胱甘肽磁珠纯化GST-AIK融合蛋白,再以rTEV酶切除GST,获得FLAG-AIK重组蛋白。最后以MTS法检测FLAG-AIK对白血病细胞HL-60的细胞毒性。菌液PCR验证和测序分析表明成功构建了重组抗瘤肽AIK的入门质粒和原核表达质粒。在BL21(DE3)工程菌中实现了GST-AIK融合蛋白的高效可溶性表达。并测得在37℃下以0.1 mmol/L IPTG诱导工程菌(OD600=1.0)4 h,重组蛋白表达量占菌体总蛋白的30%以上。经GST亲和层析、rTEV酶切除GST标签及二次GST亲和层析获得纯度高于95%的FLAG-AIK蛋白。MTS法测得所制备的FLAG-AIK蛋白抑瘤活性与化学合成的AIK相当。总之,本课题应用Gateway克隆系统成功构建了抗瘤肽AIK的原核表达质粒,实现了GST-AIK融合蛋白的高效可溶性表达,经亲和层析获得了有生物活性的重组AIK多肽,为后续深入研究和大规模制备奠定了基础。     

Tat-MANF融合蛋白的制备及生物活性研究

目的：构建用于表达具有Tat序列的新型神经营养因子MANF（mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor）融合蛋白（Tat-MANF）的重组质粒;利用原核细胞表达系统表达该重组蛋白,并检测其生物学活性。方法：以MANF cDNA为模板,利用PCR技术在上下游分别添加TAT序列和His标签及合适的限制性酶切位点,构建TAT-MANF融合基因。插入表达载体Pet22b⁺后,转化大肠杆菌BL21进行表达和纯化,用SDS-PAGE及Western印迹鉴定表达的重组蛋白。为了验证Tat-MANF的生物学活性,用30μmol/L浓度的6-羟多巴胺（6-OHDA）对神经母胶质瘤细胞（SH-SY5Y）进行毒性诱导,同时加入2μg/ml的TAT-MANF及对照MANF蛋白,24h后用流式细胞仪检测细胞的凋亡率。用脑微血管内皮细胞（B-endo3）体外模拟血脑屏障,与FITC标记的Tat-MANF共孵育4h,荧光显微镜下观察。结果：成功构建TAT-MANF融合基因,表达产物与目的蛋白大小相符,能与MANF抗体发生结合反应。重组蛋白可减少由6-OHDA导致的SH-SY5Y细胞凋亡,Tat-MANF-FITC与B-end3细胞共孵育4h后,可见细胞内明显荧光。结论：获得的重组蛋白Tat-MANF具有神经细胞保护作用及跨膜功能,为进一步开展帕金森症的体内治疗研究奠定了物质基础。     

一种新杨树菇(Agrocybe aegerita)凝集素的纯化及生化特性

用硫酸铵分级沉淀、离子交换和分子筛等方法 ,从食用菌杨树菇子实体中分离纯化了一种凝集素 ,称作为AAVP(Agrocybeaegeritaantiviralprotein) .经SDS PAGE测定其亚基的相对分子质量为15 8kD ,凝胶过滤分析分子量为 32kD .IEF PAGE计算其等电点为 3 8.AAVP不含糖 ,是一种N端焦谷氨酰环化封闭的蛋白质 ,经N端去封闭后测得N端氨基酸序列为QGVNIYNIVAGA ,用胰蛋白酶消化后得到一大片段 ,测定的氨基酸序列为PDGPWLVEK .AAVP可以凝集供试的 12种动物血和3种血型人血的血红细胞 ,但对各种血红细胞凝集滴度不同 .糖抑制实验表明 ,在供试的 18种单糖和 3种糖蛋白中 ,只有猪胃粘蛋白强烈抑制AAVP的凝血活性 .AAVP具有较好的热稳定性 ,能够忍受极端的酸碱条件 .AAVP的凝血活性不受Ca2 + 、Mg2 + 、Zn2 + 等二价阳离子的影响 .抗肿瘤活性检测表明 ,AAVP对胃癌细胞株SGC 790 1,MGC 80 3,BGC82 3及人急性白血病细胞株HL 6 0有明显的抑制作用 .AAVP对小鼠腹腔注射的半致死剂量为 15 85mg kg .     

冬小麦叶片SPAD值高光谱估测的预处理方法

为选择合适的光谱预处理方法,提高叶片SPAD值的预测精度,本研究分析冬小麦不同叶位叶片SPAD值与光谱的响应关系,对原始光谱数据进行归一化处理(NC)、多元散射校正(MSC)和基线校正(BC)及组合处理,并结合连续投影算法(SPA)和逐步多元线性回归(SMLR)构建SPAD值光谱估测模型。结果表明:增加施氮量能提高冬小麦不同叶位叶片的SPAD值,生育前期顶二叶在近红外光谱区域反射率最大,生育后期则为顶一叶最大;单一光谱预处理中基于NC处理的光谱预测模型最好(R2=0.770、RMSE=1.483),MSC处理降低了模型预测效果,组合预处理中,以BC+NC建模效果最好,R2和RMSE分别为0.755和1.540;部分预处理在一定程度上可以消减噪音,但不当的预处理方法会降低模型的预测能力;预处理方法并不是越多越好,顺序不同预测模型精度不同。     

石榴皮多酚提取物及纯化物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究

采用紫外分光光度法研究了石榴皮多酚提取物及其2种纯化物(P-1和P-2)对α-葡萄糖苷酶体外抑制作用以及纯化物对该酶的抑制作用类型.结果显示,石榴皮多酚提取物和纯化物对α-葡萄糖苷酶活性均表现出较强的抑制作用,且其作用大小与浓度呈明显的剂量-效应关系;3种多酚样品中,纯化物P-2的抑酶活性最强,纯化物P-1次之,提取物最弱,它们对α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度(IC50,mg/mL)分别为0.045、0.185和0.278.石榴皮多酚纯化物P-2对α-葡萄糖苷酶抑制作用类型为反竞争性抑制;浓度为0.01 mg/mL时该纯化物对α-葡萄糖苷酶的抑制常数Ki为1.22 μg/mL.     

抑制Toll样受体4对apoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变的影响

通过Toll样受体4(TLR4)抑制剂表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对TLR4途径的抑制,研究apoE-/- 小鼠TLR4及多种炎症因子的表达和动脉粥样硬化病变程度的改变,以探讨TLR4途径在动脉粥样硬化病变发生中的作用.5岗龄雄性apoE-/- 小鼠50只,随机分成4组:基础饮食组对照组(n=12)、高脂饮食组对照组(n=12)、基础饮食+EGCG组(n=13)、高脂饮食+EGCG组(n=13).给药14周后处死动物,从主动脉根部连续冰冻切片,油红O染色观察主动脉窦处动脉粥样硬化(As)斑块面积,定量分析主动脉粥样硬化斑块大小及占管腔的面积百分比,采用Real time-PCR检测主动脉TLR4 mRNA和CD14mRNA的表达,蛋白质印迹检测TLR4和CD14蛋白表达,ELISA检测小鼠血清中单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1,肿瘤坏死因子-α(TNF-α)浓度.研究结果提示:EGCG显著减轻apoE-/- 主动脉窦部的动脉粥样硬化病变,高脂对照组的主动脉窦AS斑块面积为(2.37±0.08)mm2,高脂饲料+EGCG组的主动脉窦AS斑块的面积为(1.05±0.13)mm2,EGCG组小鼠主动脉窦粥样斑块面积比相应对照组明显减少(P<0.05),高脂饮食+EGCG组小鼠TLR4蛋白表达显著降低(P<0.05),MCP-1,TNF-α的含量减少,与高脂饮食对照组相比差异有显著性(P<0.05).TLR4信号转导途径在高脂所致的AS发生当中有着重要作用,该信号途径的激活至少是AS发生当中的一个重要环节.     

拮抗植物病原真菌的纤维素/木质素降解菌株的筛选及鉴定

【背景】秸秆还田在改善土壤肥力和丰富营养等方面有重要作用,但是也存在秸秆难以快速降解利用和病原真菌病害威胁的问题。【目的】为解决还田秸秆的降解和病原真菌病害问题,从长期秸秆还田地区采集样品,从中筛选出具有降解秸秆和抑菌功能的菌株。【方法】采用稀释分离法、苯胺蓝染色法和刚果红染色法等对秸秆高效降解菌株进行筛选,通过16S rRNA基因测序及构建系统发育树进行菌株鉴定。采用对峙培养法测定筛选到的秸秆降解菌株对玉米大斑病菌(Setostphaeria turcica)、梨黑斑病菌(Alternaria kikuchiana)、马铃薯早疫病菌(Alternaria solani)、链格孢属真菌(Alternaria alternata) ACCC38230和ACCC38231等5种供试植物病原真菌的抑制作用。以玉米大斑病菌(Setostphaeria turcica)为后期供试植物病原真菌,测定拮抗菌株代谢产物的抑菌能力;通过观察拮抗菌株粗提液对玉米大斑病菌分生孢子萌发和菌丝生长的影响,从而测定菌株对病原真菌的抑制作用。【结果】从秸秆还田土壤中分离筛选获得3株高效降解纤维素及木质素菌株并命名为JY122、ZY133和JY215。通过形态学观察和16S rRNA基因测序鉴定上述菌株全部为芽孢杆菌属(Bacillus)。通过系统发育树分析结果表明,JY122与蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)相似性为99.4%,ZY133与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)相似性为100%,JY215与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)相似性为99.1%。平板对峙实验结果显示,JY122、ZY133和JY215菌株对不同种属的植物病原真菌均有较强的抑制作用,抑制率高达43.74%-67.54%。此外,上述芽孢杆菌代谢产物具有抑菌活性及很强的热稳定性,经95℃处理后依然具有良好的抑菌效果。【结论】筛选获得的JY122、JY133和JY215菌株具有高效降解纤维素/木质素能力,抑制多种植物病原真菌生长,代谢产物抑菌能力强且热稳定性高。这为玉米秸秆还田提供菌株资源,也为进一步解决秸秆还田难点提供了新方法和思路。     

不同氮处理下速生柳对水体氮的吸收、分配及生理响应

采用水培法,研究了旱柳苗在外源添加不同氮水平(贫氮、中氮、富氮、过氮)的铵态氮(NH+4-N)和硝态氮(NO-3-N)的生长、氮吸收、分配和生理响应。结果表明:一定范围氮浓度的增加能够促进旱柳苗的生长,但过量氮会抑制其生长,且NH+4-N的抑制作用大于NO-3-N;两种氮处理下,旱柳表现出对NH+4-N的吸收偏好,在同一氮水平时,旱柳各部位氮原子百分含量Atom%15N(AT%)、15N吸收量和来自氮源的N%(Ndff%)均为NH+4-N处理大于NO-3-N处理,且随着氮浓度的增加,差异增大,且在旱柳各部位的分布为根﹥茎﹥叶;2种氮素过量和不足均会对旱柳根和叶生理指标产生不同的影响,其中在过氮水平时,NH+4-N和NO-3-N处理下根系活力比对照减少了50.61%和增加了19.53%;在过氮水平时,NH+4-N处理柳树苗根总长、根表面积、根平均直径、根体积和侧根数分别对照下降了30.92%、29.48%、19.44%、27.01%和36.41%,NO-3-N处理柳树苗相应的根系形态指标分别对对照下降了1.66%、5.65%、1.49%、5.06%和25.72%。可见,高浓度NH+4-N对旱柳苗的胁迫影响大于NO-3-N,在应用于水体氮污染修复时可通过改变水体无机氮的比例,削弱其对旱柳的影响,从而提高旱柳对水体氮污染的修复效果。