假单胞菌Pseudomonas fluorescens Pf0-1中转录调控因子SpfB负调控DNA磷硫酰化修饰

[目的]DNA磷硫酰化修饰是DNA骨架上非桥接的氧原子以序列选择性和R-构型被硫取代的一种新型DNA修饰。目前,磷硫酰化修饰在多种细菌、古生菌以及人类致病菌中多有发现,但其分子调控机制尚不清楚。为了全面解析磷硫酰化修饰的调控机制,本文选择荧光假单胞菌Pf0-1为研究对象,开展了其DNA磷硫酰化修饰的调控机制研究。[方法]首先,构建了spfB基因缺失和回补菌株,使用碘能特异性断裂磷硫酰化修饰DNA的方法,研究了该基因缺失对修饰表型的影响。利用cDNA在相邻同方向的基因间隔区进行PCR,确定了磷硫酰化修饰基因簇spfBCDE内的共转录单元。通过荧光定量RT-PCR,分析了spfB基因缺失突变株中磷硫酰化修饰基因的转录量。利用异源表达并纯化得到的重组蛋白SpfB进行了体外功能研究。通过EMSA实验,验证了SpfB蛋白具有与spfB启动子序列结合活性。通过DNase I footprinting实验,精确定位了SpfB蛋白与DNA结合序列。[结果]spfB基因的缺失加剧了磷硫酰化修饰DNA断裂所致电泳条带弥散的表型,spfB基因的回补能够恢复该表型,证明spfB基因负调控磷硫酰化修饰。鉴定了spf基因簇中只含有1个共转录单元,且该共转录单元在△spfB突变株中转录水平明显上升。通过EMSA和DNase I footprint实验,检测了SpfB蛋白与磷硫酰化修饰基因spfBCDE的启动子区域5''-TGTTTGT-3''相结合。[结论]SpfB作为转录调控因子负调控磷硫酰化修饰基因spfBCDE的表达,为解析磷硫酰化修饰的调控机制和全面理解基因组上的部分修饰特征奠定了基础。     

杀念菌素/FR-008生物合成途径中转运基因fscTⅠ与fscTⅡ的功能

[目的]分析杀念菌素/FR-008生物合成途径中转运基因fscTⅠ和ficTⅡ的功能.[方法]构建转运基因fscTⅠ和fscTⅡ的敲除质粒pJTU4137,并通过接合转移和同源重组双交换的方法得到转运基因缺失突变株.转运基因fscTⅠ和ficTⅡ也被克隆到高拷贝质粒pJTU 1278上用于在链霉菌FR-008(Streptomyces sp.FR-008)的衍生菌株ZYJ-6中进行转运蛋白的过量表达.[结果]获得了转运蛋白缺失的双交换突变株LX10,发酵结果显示该突变株不再产生杀念菌素及其衍生物 ;过量表达转运蛋白的基因工程菌株LX11,其杀念菌素的产量约是对照菌株的1.5倍.[结论]体内遗传实验进一步证实FR-008生物合成途径中的fscTⅠ和fscTⅡ是ATP依赖的ABC转运基因,fscTⅠ与fscTⅡ的过量表达增加了杀念菌素的产量,为利用此方法提高其它多烯类抗生素的产量提供了例证.     

灭癌素链霉菌中磷硫酰化修饰DNA结合结构域的功能分析

[目的]DNA磷硫酰化(phosphorothioation,PT)是由硫原子取代DNA骨架磷原子上的非桥联氧原子形成的一种新型DNA修饰.PT修饰除参与组成限制修饰系统外,其更为广泛的生物学功能仍有待揭示.PT修饰现有的检测方法操作复杂、成本高、耗时长,而具有操作简便、成本低、耗时短等特点的酶联免疫检测(enzyme...     

基于基因组挖掘的农抗120活性成分制霉菌素和丰加霉素的发现和鉴定

【目的】分析刺孢吸水链霉菌北京变种(农抗120产生菌)基因组和次级代谢产物组分,研究并鉴定农抗120产生菌中未被发现的活性组分。【方法】利用antiSMASH在线分析农抗120产生菌Streptomyces hygrospinosusvar.beijingensis基因组信息,锁定可能的制霉菌素和丰加霉素生物合成基因簇。利用HPLC和LC-MS等分析方法对农抗120产生菌发酵产物进行分析,同时利用制霉菌素和丰加霉素标准品作为对照,以鉴定该菌株代谢组分中的次级代谢产物。此外,通过构建目标基因簇大片段缺失突变株,并对所得突变株发酵产物进行检测,以确定生物合成基因簇与目的代谢产物的对应关系。【结果】本研究综合利用基因组序列分析、基因缺失突变株构建以及代谢产物检测方法,鉴定了农抗120产生菌中制霉菌素和丰加霉素两种活性成分,并确定了负责这些化合物合成的基因簇。【结论】本研究所构建的多重基因簇失活突变株为挖掘刺孢吸水链霉菌北京变种更多的天然次级代谢产物奠定了基础。     

金霉素生物合成基因簇中调控基因ctcB的功能

【目的】研究金霉素产生菌中SARP家族转录调控基因ctc B的作用。【方法】利用大肠杆菌、链霉菌的属间接合转移和同源重组双交换的方法,构建ctc B基因缺失突变株。通过c DNA在相邻同转录方向的基因间隔进行PCR验证,确定金霉素生物合成基因簇中的转录单元。利用荧光定量RT-PCR方法进行突变株金霉素生物合成基因簇的转录水平检测。随后,生物信息学预测分析了金霉素生物合成基因簇内Ctc B与DNA的结合位点。【结果】获得了ctc B基因缺失的双交换突变株。发酵结果显示,该突变株失去产生金霉素与四环素的能力。金霉素生物合成基因簇内有6个共转录单元,其中4个共转录单元在ctc B基因缺失突变株中转录水平明显下降。软件分析预测到一致性较高的Ctc B结合重复序列。【结论】ctc B正调控金霉素生物合成结构基因ctc G-D、ctc H-K、ctc N-P、ctc W-T 4个转录单元和ctc Q,为进一步研究ctc B调控机制奠定了基础。     

黄脂菌素生物合成基因簇中调控基因xanR3的功能

【目的】研究黄脂菌素产生菌灰黄链霉菌中编码ArsR家族转录调控蛋白(Arsenical resistance regulator)的xanR3基因的功能。【方法】利用大肠杆菌和链霉菌双亲本接合转移的方法,构建xanR3基因缺失突变株及回补突变株。利用cDNA在相邻同方向的基因间隔区进行PCR确定黄脂菌素生物合成基因簇中的转录单元。利用荧光定量RT-PCR方法进行突变株中黄脂菌素生物合成基因簇转录水平的检测。【结果】对得到的xanR3基因缺失突变株及回补突变株进行发酵,发现xanR3基因缺失突变株产黄脂菌素能力下降,回补菌株中黄脂菌素产量相比缺失突变株有一定程度的恢复,但仍未达到野生型水平。经鉴定,黄脂菌素生物合成基因簇中共有18个共转录单元,其中4个共转录单元在?xanR3突变株中转录水平明显下降。【结论】ArsR家族转录调控基因xanR3是黄脂菌素生物合成的正调控基因。     

假单胞菌Pseudomonas fluorescens Pf0-1中转录调控因子SpfB负调控DNA磷硫酰化修饰（英文）

【目的】DNA磷硫酰化修饰是DNA骨架上非桥接的氧原子以序列选择性和R-构型被硫取代的一种新型DNA修饰。目前,磷硫酰化修饰在多种细菌、古生菌以及人类致病菌中多有发现,但其分子调控机制尚不清楚。为了全面解析磷硫酰化修饰的调控机制,本文选择荧光假单胞菌Pf0-1为研究对象,开展了其DNA磷硫酰化修饰的调控机制研究。【方法】首先,构建了spfB基因缺失和回补菌株,使用碘能特异性断裂磷硫酰化修饰DNA的方法,研究了该基因缺失对修饰表型的影响。利用cDNA在相邻同方向的基因间隔区进行PCR,确定了磷硫酰化修饰基因簇spf BCDE内的共转录单元。通过荧光定量RT-PCR,分析了spfB基因缺失突变株中磷硫酰化修饰基因的转录量。利用异源表达并纯化得到的重组蛋白SpfB进行了体外功能研究。通过EMSA实验,验证了SpfB蛋白具有与spfB启动子序列结合活性。通过DNase I footprinting实验,精确定位了Spf B蛋白与DNA结合序列。【结果】spf B基因的缺失加剧了磷硫酰化修饰DNA断裂所致电泳条带弥散的表型,spf B基因的回补能够恢复该表型,证明spf B基因负调控磷硫酰化修饰。鉴定了spf基因簇中只含有1个共转录单元,且该共转录单元在?spfB突变株中转录水平明显上升。通过EMSA和DNase I footprint实验,检测了SpfB蛋白与磷硫酰化修饰基因spf BCDE的启动子区域5′-TGTTTGT-3′相结合。【结论】SpfB作为转录调控因子负调控磷硫酰化修饰基因spf BCDE的表达,为解析磷硫酰化修饰的调控机制和全面理解基因组上的部分修饰特征奠定了基础。     

羊毛硫肽SapB类多肽促进链霉菌形态分化作用的研究

【目的】链霉菌属于革兰氏阳性菌,以复杂的形态分化过程和强大的次级代谢产物合成能力为主要特征。链霉菌的形态分化与次级代谢产物的产生密切相关。Ⅲ型羊毛硫肽SapB能够促进天蓝色链霉菌气生菌丝体形成,暗示这类多肽可以作为靶标用于形态分化改造工程开发。本研究表征了SapB类多肽对多种链霉菌形态分化的影响,为该类多肽的工程化应用提供理论基础。【方法】生物信息学分析多个链霉菌基因组中SapB类多肽的生物合成基因簇,构建SapB类多肽的异源表达载体,利用接合转移方法导入不同链霉菌中进行异源表达,探究SapB类多肽对链霉菌形态分化的影响。【结果】SapB类多肽在不同程度上促进了多个链霉菌由营养菌丝向气生菌丝分化,表现为气生菌丝体数量的增多和分化速度的加快,缩短了链霉菌形态分化周期。【结论】SapB类多肽的过表达有助于缩短链霉菌形态分化周期,可用于针对链霉菌形态分化的工程改造。     

杀念菌素/FR-008生物合成途径中转运基因fscTI与fscTII的功能

摘要:【目的】分析杀念菌素/FR-008 生物合成途径中转运基因fscTI和fscTII的功能。【方法】构建转运基因fscTI和fscTII的敲除质粒pJTU4137,并通过接合转移和同源重组双交换的方法得到转运基因缺失突变株。转运基因fscTI和fscTII也被克隆到高拷贝质粒pJTU1278上用于在链霉菌FR-008(Streptomyces sp．FR-008)的衍生菌株ZYJ-6中进行转运蛋白的过量表达。【结果】获得了转运蛋白缺失的双交换突变株LX10,发酵结果显示该突变株不再产生杀念菌素及其衍生物;过量表达转运蛋白的基因工程菌株LX11,其杀念菌素的产量约是对照菌株的1.5倍。【结论】体内遗传实验进一步证实FR-008生物合成途径中的fscTI和fscTII是ATP依赖的ABC转运基因,fscTI与fscTII的过量表达增加了杀念菌素的产量,为利用此方法提高其它多烯类抗生素的产量提供了例证。