拆分获得(S)-酮基布洛芬脂肪酶基因在枯草芽孢杆菌中的克隆与表达

【目的】筛选具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的脂肪酶基因,构建其表达分泌型工程菌,并进一步提高该脂肪酶的立体选择性。【方法】以自筛选出的一株具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的菌株NK13为材料,通过构建其基因组文库,筛选具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的脂肪酶基因。通过构建该脂肪酶基因的分泌型诱导表达载体pHY300-plk-sacR-gene,将其转入枯草芽孢杆菌WB600,获得基因重组菌WB600(pHY300-plk-sacR-gene)。用SDS-PAGE检测其表达和转化情况,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法纯化脂肪酶;并利用TLC和HPLC检测该酶的立体选择专一性。【结果】得到了具有专一性拆分获得(S)-酮基布洛芬能力、长度为633bp的脂肪酶基因(GenBank登录号为:EU381317)。该脂肪酶在枯草芽孢杆菌WB600中得到了分泌表达。TLC和HPLC检测结果显示,纯化的脂肪酶对底物转化40h时转化率为30%,生成(S)-酮基布洛芬的e.e.%值最高,达60.02%,与未加Tween-80的枯草芽孢杆菌转化子体系相同。而在含Tween-80的环境下,枯草芽孢杆菌表达重组菌对底物转化36h时转化率约为45%,生成(S)-酮基布洛芬的e.e.%值最高,达93.64%,是野生菌NK13的16倍。【结论】从NK13号菌株中筛选得到的新的脂肪酶具有很高的不对称拆分获得(S)-酮基布洛芬的能力,实现了NK13菌中633bp脂肪酶基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达,研究证明Tween-80能提高该脂肪酶的拆分专一性。     

拆分获得(R)-酮基布洛芬酯酶基因的筛选、克隆与表达

以自筛选出的具有一定不对称拆分外消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的野生菌Bacillus megaterium NK13为材料,通过构建其基因文库,筛选得到一个阳性克隆重组子pUC18-NK-HYD3。分析测序结果发现外源片段中包含一段完整的741 bp的开放阅读框,其编码的蛋白中含有酯酶的GXSXG保守序列。经在NCBI的BLAST系统中比对,证明该酯酶基因属于首次发现(GenBank Accession Number: GU143552)。将酯酶基因克隆到载体pET21b(+)中,转化E. coli BL21(DE3),经IPTG诱导后在宿主菌得到表达。SDS-PAGE电泳检测证明该酯酶蛋白分子量约为28 kDa。TLC和HPLC检测结果显示,该酯酶优先水解(R)-型底物,在重组菌菌液体系,转化率为15%时,酯酶拆分获得(R)-酮基布洛芬的过量值(e.e.%)最高,达62.74％;改用重组菌湿菌体的PBS体系后,在转化率为10%~50%时,酯酶拆分获得(R)-酮基布洛芬的过量值(e.e.%)一直保持在73%~76%之间。