利用CRISPR/Cas9双元转基因体系探究家蚕配子生成素结合蛋白基因Bmggnbp2的功能

【目的】配子生成素结合蛋白2(gametogenetin binding protein 2,ggnbp2)在哺乳动物配子发生等生殖相关过程中发挥重要作用。本研究以家蚕Bombyx mori为模型,探究驯化基因ggnbp2的生物学功能,为鳞翅目昆虫中该基因的深入研究提供线索。【方法】在NCBI GenBank数据库通过序列比对检索到翅目昆虫ggnbp2基因的序列;通过贝叶斯法构建系统发育树进行ggnbp2基因的系统发育分析。根据我们前期研究建立的家蚕-野桑蚕Bombyx mandarina群体基因组多态性数据,对家蚕中Bmggnbp2进行选择信号分析;利用已发表的基因芯片数据分析Bmggnbp2在家蚕5龄第3天幼虫中的组织表达特征。利用CRISPR/Cas9双元转基因体系构建Bmggnbp2敲除突变体,测定分析突变体与对照品系Nos-Cas9在繁殖性状(单雌产卵量和卵孵化率)以及与对照品系U6-Bmggnbp2 sgRNA和Nos-Cas9经济性状(全茧重、蛹重和茧壳重)的差异。【结果】ggnbp2在鳞翅目昆虫中广泛存在,且高度保守,并且在家蚕中具有强烈的人工选择信号。Bmggnbp2在家蚕5龄第3天幼虫的脑、卵巢、精巢和丝腺中均高度表达。利用CRISPR/Cas9双元转基因体系成功获取家蚕Bmggnbp2基因的嵌合体敲除突变体△Bmggnbp 2。与对照Nos-Cas9精巢的典型肾形不同,突变体△Bmggnbp 2的精巢呈椭圆形,并且表面出现一层较厚的黄色覆盖物,但突变体△Bmggnbp 2单雌产卵量和卵孵化率与对照品系Nos-Cas9以及全茧重、蛹重和茧壳重与对照U6-Bmggnbp2 sgRNA和Nos-Cas9均没有显著差异。【结论】GGNBP2在鳞翅目昆虫中对繁殖的影响可能并没有在哺乳动物中那么至关重要,其具体的作用机制仍需要进一步探讨。     

hnRNPA1基因在家蚕翅原基组织中的表达与定位分析

核不均一蛋白A1(hnRNPA1)是一个重要的RNA结合蛋白。本研究旨在获得家蚕hnRNPA1基因的cDNA,并对其在家蚕翅原基组织进行表达和定位分析。以家蚕幼虫期翅原基mRNA为模板通过反转录克隆家蚕BmhnRNPA1基因的全长cDNA,并对其进行生物信息学分析。构建pET32a-BmhnRNPA1蛋白表达载体,表达且纯化得到BmhnRNPA1重组蛋白,并制备该蛋白多克隆抗体,通过实时荧光定量RT-PCR、Western blot和免疫组化方法检测BmhnRNPA1在家蚕幼虫和蛹翅原基组织中的表达与定位。克隆得到了家蚕hnRNPA1基因的全长cDNA片段,其开放阅读框(ORF)序列为951 bp,编码316个氨基酸,预测分子量为34.98 kDa,等电点为5.15。编码蛋白在第18～90个氨基酸和109～181个氨基酸处为保守的RRM结构域。系统进化分析显示,家蚕hnRNPA1与小菜蛾hnRNPA1的亲缘关系最近。QRT-PCR结果显示,BmhnRNPA1在家蚕幼虫和蛹期的翅原基组织中均有表达,且在蛹期第3天的表达量达到峰值。Western blot进一步证实了实验结果。免疫组化分析结果显示,该蛋白存在于翅原基组织中,并定位于细胞核内。家蚕BmhRNPA1具有两个RNA结合结构域,属于hnRNPs家族,定位于细胞核内,表明其可能参与mRNA的选择性剪接作用。本研究结果为进一步探索该基因的功能提供了基础。     

家白蚁中肠具有内切葡聚糖酶活性菌株的分离和鉴定

从家白蚁中肠分离得到了一株具有内切β-1,4-葡聚糖酶活性的细菌Streptomyces sp.Cf1,并经过16S rRNA和形态分析确定为属于链霉菌属(Streptomyces)一种.该菌具有内切β-1,4-葡聚糖酶活性但不具有糖苷酶活性.该菌所分泌的内切β-1,4-葡聚糖酶活性最大可达8.25 U/mg.菌株分泌酶活性的最适pH值为6～7,最适温度为60℃.从家白蚁中肠分离得到这一具内切葡聚糖酶活性的菌株表明,家白蚁中肠细菌可以通过分泌内切葡聚糖酶与白蚁内源性内切葡聚糖酶一道参与食物中纤维素的降解.     

果蝇翅原基发育分化的主要过程及分子机理

翅原基发育分化与昆虫的个体发育紧密联系, 对昆虫翅发育的研究有助于阐述昆虫的发育过程。另外, 翅的形成是一些农林害虫泛滥的主要原因之一, 研究翅发育分化有助于我们从翅发育的角度控制农林害虫。目前, 翅发育分化在果蝇Drosophila中研究已较为深入详细。果蝇翅发育分化主要包括4个阶段： 翅原基（wing disc）的确定, 前-后（antero-posterior, A-P）和背-腹（dorso-ventral, D-V）组织中心（organizing center）的建立, 翅区（wing region）的确定, 以及翅区的进一步分化。具有homeobox序列的基因（homeobox 基因）如Engrailed (En)、 Apterous (Ap)和Ultrabithorax (Ubx), 分泌蛋白如Wnt家族成员Wingless (Wg)及TGF-β超家族成员Decapentaplegic (Dpp)和Hedgehog (Hh), 以及翅原基特有的核蛋白编码基因Vestigial (Vg), 共同调控了翅原基的正常发育分化。本文综述了果蝇翅原基发育分化的过程及分子机理方面的研究发现, 为翅原基的研究提供了参考。     

昆虫变态发育过程中的细胞自噬和凋亡

在昆虫变态期,幼虫组织发生退化或消亡,原因在于蜕皮甾醇激素（ecdysteroid）,即通常所说的蜕皮激素,诱导这些组织的细胞发生了自噬(autophagy)和凋亡(apoptosis)的程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)。一般情况下,自噬途径构成一种饥饿应激适应性以避免细胞的死亡,表现为低水平Cvt泡(Cvt vesicle)和自噬体(autophagosome)对部分胞质溶胶、蛋白聚集体和细胞器的吞噬和降解。昆虫进入变态发育时,由于蜕皮激素的激活,由遗传级联系统调控的PCD机制被启动,低水平的常态自噬转入高水平的自噬并同时诱发凋亡,细胞进入不可逆的死亡,导致幼虫组织在变态期退化或消亡。对果蝇Drosophila变态期PCD机制中最重要的发现是:（1）在自噬发生的PI3KⅠ- Tor 和 PI3KⅢ的分子通路中,由自噬相关蛋白Atg1引发的高水平自噬能够诱导凋亡;（2）蜕皮激素诱导表达的βFTZ-F1,E93,BR-C,E74A等转录因子不但激活凋亡的Caspases通路,还能诱导自噬的发生。     

情系教育几十载，大爱无言铸师魂——记我国著名的植物生理学家和教育家潘瑞炽

投身教育,报效祖国 潘瑞炽教授在解放初期毅然从台湾回到大陆,投身国家建设。以“先天下之忧而忧,后天下之乐而乐”为己任,体现出中国知识分子的责任感和使命感。潘瑞炽教授身体力行并谆谆教导学生,要把个人的命运与国家的发展联系起来,不管在什么样的工作岗位。     

草地贪夜蛾与斜纹夜蛾解毒相关基因的比较分析

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda近期在中国为害猖獗,由于繁殖速度快,迁飞能力强,在本土呈现爆发趋势,严重为害了我国农作物。与本地近缘物种斜纹夜蛾Spodoptera litura相比,草地贪夜蛾更偏好玉米、水稻、小麦等禾本科农作物,且对多种化学杀虫剂及转基因Bt玉米产生抗性。寄主适应性以及杀虫剂抗性与解毒代谢相关蛋白密切相关。因此,本研究对这两种夜蛾科害虫的解毒代谢相关蛋白——细胞色素P450、谷胱甘肽转移酶(GST)及ABC转运蛋白进行了全基因组水平系统的搜集和数目比较,构建系统发育树并对P450和GST部分基因扩张分支进行氨基酸差异位点分析。结果显示,在草地贪夜蛾中共鉴定出213个P450基因、58个GST基因、102个ABC基因,其中P450基因与GST基因数目远远多于斜纹夜蛾(116,37),而ABC基因数目与斜纹夜蛾(99)接近。系统发育树分析表明,草地贪夜蛾P450在CYP6、CYP9以及CYP4功能簇,GST在部分进化分支上都发生了显著基因扩张,发生显著扩张的基因中有数个氨基酸突变,其中一些突变被预测可能影响蛋白质功能。但出乎意料的是,ABC亚家族B和E在斜纹夜蛾聚集成簇并发生了显著的基因扩张现象。以上结果暗示入侵种草地贪夜蛾和本地近缘物种斜纹夜蛾在抗性方面可能发展出各自独特的应对机制。本研究为解析草地贪夜蛾解毒抗性特征机制提供基因数据,为草地贪夜蛾的生物防治及抗性研究提供参考依据。     

蜜蜂肠道微生物研究进展

蜜蜂是全球范围内重要的授粉昆虫,具有很高的经济、生态效益。但是蜜蜂一生中可能会遇到许多挑战。肠道微生物与蜜蜂的健康息息相关,不仅在营养物质的消化吸收方面有重要作用,而且还能抵抗某些病原菌的侵袭以及增强机体免疫力。近年出现的蜜蜂大量死亡现象可能与肠道微生物失调有关。生物以及非生物的因素都可能密切影响着蜜蜂肠道微生物的存活,导致宿主生理功能紊乱甚至死亡。本文综述了蜜蜂的肠道核心微生物组成、分布、变化、影响因素以及主要作用和研究方法,为肠道微生物的研究和利用提供参考。     

斜纹夜蛾中肠糖代谢相关基因的克隆及表达模式分析

斜纹夜蛾Spodoptera litura是一种世界性分布的重要农业害虫, 在生长发育过程中要经历幼虫 蛹的变态发育过程。由于变态发育前后昆虫的食性发生了明显的改变, 作为食物消化吸收的中肠也发生了解体和重建。与此相适应, 昆虫中肠的各种物质和能量代谢也可能会相应地发生改变。为研究斜纹夜蛾中肠变态发育过程中糖代谢途径的变化情况, 我们从斜纹夜蛾中肠EST文库中鉴定出了12个糖代谢相关基因, 克隆了其中3个基因的全长cDNA, 并应用半定量PCR和定量PCR的方法检测了其在幼虫 蛹变态发育期中肠组织的转录表达以及对激素和饥饿等因素的响应情况。结果表明： 这3个基因（α-L-岩藻糖苷酶、 N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸去乙酰酶和烯醇化酶基因）的开放阅读框分别为1 461, 1 200和1 299 bp, 预测的分子量分别为56.3, 43.3和46.7 kDa。这12个糖代谢相关的基因在变态发育期的中肠组织中具有5种不同的mRNA表达模式： （Ⅰ）只在幼虫期高表达（唾液麦芽糖酶前体蛋白、 糖基水解酶31家族成员蛋白、 线粒体乙醛脱氢酶、 β-1,3 葡聚糖酶基因）; （Ⅱ）只在预蛹期高表达（β-葡萄糖醛酸酶、 β-N-酰基氨基葡萄糖苷酶3基因）; （Ⅲ）只在蛹期高表达（葡萄糖胺-6-磷酸异构酶基因）; （Ⅳ）在预蛹期和蛹期高表达（α-葡萄糖苷酶、 α-淀粉酶、 N-乙酰葡糖胺 6 磷酸脱乙酰酶和α-L-岩藻糖苷酶基因）; （Ⅴ）在变态发育期恒定表达（烯醇化酶基因）。这说明, 为适应变态发育斜纹夜蛾中肠糖代谢途径发生了明显的改变。保幼激素对这些基因的表达没有明显的影响, 但蜕皮激素对Ⅰ类基因（如糖基水解酶31家族成员蛋白基因）具有一定的抑制作用, 对Ⅲ类基因（如葡萄糖胺-6-磷酸异构酶基因）有显著的上调作用。此外, 我们还发现饥饿对几乎所有这些基因的表达都有显著的抑制作用。这些结果说明, 昆虫中肠变态发育过程中糖代谢相关基因的动态变化可能受到蜕皮激素以及饥饿相关因素的共同调控。这一研究对从代谢角度揭示昆虫变态发育的分子机理具有重要意义。