MyoD基因对肉牛胴体性状影响的分析

用PCR技术克隆到MyoD基因的第二内含子, 采用PCR-SSCP方法研究了3个黄牛品种(鲁西牛、晋喃牛、秦川牛)及4个杂交肉牛(夏洛莱×鲁西牛、安格斯×鲁西牛、利木赞×鲁西牛、西门塔尔×鲁西牛)群体MyoD基因的多态性, 并分析了基因位点多态性与肉牛肉质性状的相关性。实验结果,在国内首次扩增出肉牛MyoD基因的第二内含子的全部序列, 共261 bp。用SSCP方法检测到MyoD基因内含子2有A和B两个等位基因。测序结果表明该座位的多态性是由于内含子二39 bp处C-T的突变和112 bp处C→G的突变造成的。等位基因B在中国地方品种的分布频率高于引进品种的杂交牛群体。c2检验的结果表明, 在该位点的除夏洛莱和安格斯杂交牛外, 其余五个群体(晋南、鲁西、秦川、西门塔尔杂交牛和利木赞杂交牛)均处于Hardy-Weinberg不平衡状态(P>0.05)。实验群体不同基因型与肉牛的宰前活重、胴体重、净肉重、高档肉重、眼肌面积等性状的影响差异极显著或显著(P<0.01或P<0.05), 并且AA型个体均高于AB型个体。     

非人灵长类动物基因编辑技术的应用及挑战

建立有效的动物模型是研究人类疾病演进、开发新型治疗手段的重要方法。非人灵长类动物在进化发育、生理生化及病理方面和人类最接近,是研究人类疾病的理想动物模型。随着基因编辑技术的发展,研究者已经成功建立了多种模仿人类疾病的非人灵长类动物模型。但是CRISPR/Cas9的脱靶效应、嵌合突变以及基因敲入效率较低等突出问题也逐渐引起重视。本文综述了基因编辑技术在建立非人灵长类动物模型中的应用现状,提出了目前亟需解决的难点和应对策略,以期为高效、准确构建非人灵长类动物模型提供借鉴与参考。     

牛ACAD8基因结构及其多态性与生产性状的关联分析

乙酰辅酶A脱氢酶(ACAD)是由核基因编码存在于线粒体中黄色酶的一个家族,它催化脂肪酸的α和β-氧化,该家族第八成员负责催化缬氨酸分解代谢。本研究中获得了牛的ACAD8基因的mRNA和基因组DNA序列并通过基因组DNA与mRNA的比对确定了其基因结构。其mRNA序列包含一个1,251 bp的开放阅读框,一个37 bp 的5′非翻译区和一个 444 bp 的 3′非翻译区;其基因组DNA全长13,814 bp,包含11个外显子和10个内含子。我们从样本中随机选取6个个体进行扩增测序,结果表明牛的ACAD8基因13,408位(GenBank登录号:DQ435445)一个A-G单核苷酸多态。运用PCR-RFLP对不同的基因型进行了区分。对该SNP与来自5个品种共178头无亲缘关系的牛的生产性状进行了关联分析,结果表明:该A-G单核苷酸多态对日增重和嫩度有显著影响(P < 0.05)。具有G等位基因的牛比具有A等位基因的牛生长较快,其肉质也较嫩。因此,牛ACAD8基因在该位点的单核苷酸多态可以作为提高生长速度和牛肉嫩度的标记。     

不同基因型对南阳牛生长发育性状的影响

以南阳牛为实验动物,利用PCR-SSCP和PCR-RFLP技术研究了南阳牛生长激素(GH)基因,IGF-I基因以及IGF-IBP3基因的遗传多态,并分析了遗传多态位点对南阳牛0月龄、6月龄、12月龄、18月龄、24月龄以及36月龄不同生长时期生长发育性状的影响.结果表明: 在6月龄～18月龄,GH基因的GH-P5位点的BB基因型对南阳牛的体长、体高显著的正效应;在生长的后期(24月龄～36月龄),IGF-IBP3-P5基因位点对南阳牛的后躯发育起主要调控作用,BB基因型个体的尻宽显著高于AA型.这表明基因的正效应不是在所有的生长周期表现,而是在特定的时期内表现对南阳牛生长发育的显著影响.     

不同生长时期基因调控对南阳牛生长发育的影响

以南阳牛为试验动物,利用PCR-SSCP和PCR-RFLP技术研究了南阳牛生长激素（GH）基因,IGF-I基因以及IGF-IBP3基因的遗传多态,并分析了遗传多态位点对南阳牛0月龄、6月龄、12月龄、18月龄、24月龄以及36月龄不同生长时期生长发育性状的影响。结果表明： 在6月龄～18月龄,GH基因的GH-P5位点的BB基因型对南阳牛的体长、体高显著的正效应;在生长的后期（24月龄～36月龄）,IGF-IBP3-P5基因位点对南阳牛的后躯发育起主要调控作用,BB基因型个体的尻宽显著高于AA型。这表明基因的正效应不是在所有的生长周期表现,而是在特定的时期表现对南阳牛生长发育的显著影响。     

牛FABGL基因的克隆及其与牛生物经济学性状的相关分析

运用同源序列克隆技术结合反转录PCR技术和3′,5′cDNA末端快速扩增技术得到了牛FABGL基因的完整CDS,3′非翻译区和部分5′非翻译区.序列分析和生物信息学研究表明,所获得的牛FABGL基因的cDNA包含994个核苷酸和780 bp的开放阅读框及198 bp的完整的3′非翻译区.该基因编码260个氨基酸残基蛋白,在氨基酸水平上与人的同源基因具有高度的相似性(88%).采用PCR-SSCP方法,在递交的包含完整CDS的长为1 925 bp的该基因的基因组DNA序列(GenBank接受号DQ409814)1 065 bp 和1 792 bp处,分别发现了两个单核苷酸碱基突变Y=C/T,R=A/G;它们分别位于该基因的第五和第八内含子.对包含这两个多态位点的3个品种(安格斯、海福特和西门塔尔)牛的共179个个体等位基因频率与部分肉质及生长性状进行了关联分析,结果发现,在第八内含子内具有GG基因型的个体的肉用性能指数(4.283±.0.475kg/cm)较具有AA基因型个体的(4.008±0.465kg/cm)高(P≤0.01);而且同一位点具有GG基因型的个体的眼肌面积(73.380±13.005 cm2)显著高于具有AA基因型的个体(67.744±12.777 cm2)(P≤0.05).在第五内含子内,具有CC、CT、TT3种不同基因型的个体之间,平均日增重差异均达到极显著水平(P≤0.01),以具有TT基因型的个体平均日增重最高(0.652±0.330kg/d),CC基因型的最低(0.421±0.178kg/d).     

牛IRAK2基因有两种选择性剪接表达产物

Toll样受体（TLRs）可识别病原体相关分子模式,在天然免疫和适应性免疫应答中起着重要的作用.IRAK2为TLRs信号转导中的重要分子,对信号转导及调节有着重要的作用.为了深入研究牛TLRs介导的信号转导通路对牛病原体所致疾病抗性中的作用,本研究采用RT-PCR和RACE方法克隆了牛IRAK2基因,并分析了基因序列,及其编码蛋白质的结构和功能预测. 结果表明,牛IRAK2存在2个选择性剪接产物IRAK2a和IRAK2b,其cDNA长度分别为2 148 bp和2 001　bp(GenBank登录号为EU528620和EU528621),分别编码622个和384个氨基酸.与IRAK2a相比,IRAK2b缺少第3外显子147 bp片段,使得起始密码子后移,IRAK2a蛋白含有DD结构域和S-TKc结构域,而IRAK2b则缺少DD结构域,只有部分S-TKc结构域.     

单细胞PCR体系的建立及其在CRISPR/Cas9靶点活性检测中的应用

单细胞PCR是以单个细胞所含的DNA或RNA为模板进行扩增,因此其模板的制备是影响整个反应成功与否的关键因素。利用三种不同蛋白酶K细胞裂解液(SDS细胞裂解液、NP-40细胞裂解液、Tween-20细胞裂解液)分别对体外培养成熟的单个猪卵母细胞进行裂解,并直接作为模板进行PCR扩增,结果表明:NP-40细胞裂解液制备的模板质量最好,其扩增效率为95%;其次为Tween-20细胞裂解液,其扩增效率为65%;SDS细胞裂解液产物中未检测到阳性条带。结合显微注射技术对sgRNA靶点活性进行检测,结果表明利用单细胞PCR结合显微注射的方法,在受精卵内对CRISPR/Cas9靶点活性进行检测确实可行,检测结果真实可靠。     

牛α辅肌动蛋白(α-Actinin)1 基因遗传变异与产犊数性状的相关性

为了探讨辅肌动蛋白1(α-actinin1)基因对母牛产犊数的影响,以鲁西单胎牛,鲁西双胎牛,南阳牛,晋南牛,荷斯坦牛,三河牛和延边牛为研究对象,以α-actinin1为影响产犊数的候选基因,分别扩增418 bp和505 bp 2个片段,采用直接测序,RFLP-RsaⅠ和RFLP-Apa Ⅰ方法检测α-actinin1基因的多态性,并将其与产犊数性状进行了关联分析.在内含子15 第227 nt处的碱基发生G→A突变,和内含子10第3 124 nt处发生A→G突变,使其产生酶切多态.对2个酶切多态位点进行基因型分型,χ2检验表明：在G227A位点,除了鲁西单胎牛外,其他群体都已达到Hardy-Weinberg平衡;在A3 124G位点,除了鲁西双胎牛外,其余群体都已经达到Hardy-Weinberg平衡.SAS 9.0的最小二乘拟和一般线性模型分析结果表明：A3 124G位点的AG基因型的产犊数的最小二乘均数极显著（P＜0.01）高于基因型AA;而单倍型组合G G的产犊数的最小二乘均数显著高（P＜0.01）于其它3种单倍型组合.α-actinin1基因有可能作为产犊数性状的候选分子的遗传标记.     

奶牛TLR4基因的多态性与乳房炎的相关性研究

TLR4通过识别病原体而激活免疫细胞,在先天免疫和适应性免疫防御中起着重要作用。以中国荷斯坦奶牛、三河牛和中国西门塔尔牛为研究对象,以TLR4为乳房炎抗性的候选基因,分别扩增316bp和382bp2个片段,分别采用SSCP和RFLP-AluⅠ方法来检测TLR4基因的多态性。结合测序发现:在intron1的第4,525bp处的A→G的突变,和exon3的第1,397bp处的T→C突变,使得产生多态。2个位点的A、B等位基因在3个群体中都有分布,且处于中度多态。χ2适合性检验表明,3个群体在这2个位点的突变达到Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。运用SAS8.0软件采用最小二乘法拟合线性模型,将基因座不同基因型与奶牛乳房炎进行了关联分析,结果表明:T4CRBR1的AA基因型为乳房炎抗性基因型(P<0.05),A等位基因为乳房炎抗性的有利基因,T4CRBR2的各基因型个体间的体细胞评分差异不显著(P>0.05)。