湖北地区宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型E7基因的分离、克隆和序列分析

采用加端聚合酶链反应技术,从湖北地区一宫颈癌患者癌组织ＤＮＡ中分离出人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）Ｅ７基因,并在ｐＵＣ１８载体中克隆。经限制性核酸内切酶分析和ＤＮＡ序列分析,确认了含ＨＰＶ１６Ｅ７重组克隆质粒,命名ｐＨＰＶ１６Ｅ７─ＨＢ。ＤＮＡ序列分析表明,ＨＰＶ１６Ｅ７─ＨＢ基因全长２９４ｂｐ（与报道的标准株基因长度相同）,但其核苷酸顺序中有两处发生了Ｃ→Ｔ突变,即第４３位密码子ＣＡＡ变为ＴＡＡ,第７６位ＣＧＴ变为ＴＧＴ;前者使谷氨酰胺密码子变为终止密码,即无义奕变（ｎｏｎｓｅｎｓｅｍｕｔａｔｉｏｎ）。这种突变发生在２９４个碱基的ＤＮＡ扩增产物之中,不像是ＰＣＲ本身的错配,而很可能是湖北株与标准株之间的结构差异。     

测定T_4-RNA连接酶活力的新方法及tRNA单加反应条件的研究

本文对T_4-RNA连接酶催化tRNA单加pCp的反应条件进行了探讨。tRNA单加pCp的反应在37℃进行1小时,产率一般可达80%以上,条件适当时可达定量产率。利用这个反应建立了一个T_4-RNA连接酶活力测定的新方法。单加活力单位定义为,在标准条件下,37℃,60分钟,催化tRNA单加pCp产生1 pmole产物的酶量为1单加活力单位。1单加活力单位约相当于0.58焦磷酸交换单位。用该方法进行T_4-RNA连接酶制备过程的活力测定表明,该方法适合于纯酶制剂的活力测定也适合于粗酶制剂的活力测定。     

人类淋巴细胞干扰素的简易部分纯化方法

干扰素的纯化是一个重要的问题,对临床疗效与应用研究将有很大的推动作用。七十年代,特别是最近几年以来,干扰素的纯化研究取得了重大的进展,人的α及β型干扰素已基本上纯化了,但由于细胞(特别是人白细胞)来源困难以及单层细胞培养产量受限制,故干扰素仍然供不应求。1975年Strander等发现一株“人类淋巴细胞”(Namalwa)可以诱导产生干扰素,因为它来源方便,又可连续传代及大规模悬浮培养,还可在无血     

人类淋巴细胞干扰素的简易部分纯化方法

干扰素的纯化是一个重要的问题,对临床疗效与应用研究将有很大的推动作用。七十年代,特别是最近几年以来,干扰素的纯化研究取得了重大的进展,人的α及β型干扰素已基本上纯化了,但由于细胞(特别是人白细胞)来源困难以及单尾细胞培养产量受限制,故干扰素仍然供不应求。1975年Strander等发现一株“人类淋巴细胞”(Namalwa)     

汉坦病毒感染细胞整合素受体信号转导相关差异表达基因筛选

通过基因芯片技术观察汉坦病毒感染细胞后整合素受体信号转导相关基因的差异表达,以探讨汉坦病毒进入细胞的分子机制.用汉滩病毒76-118株感染原代人胚肺成纤维细胞,同时设立正常对照细胞,于感染后第6h、24h和96h同时抽提感染组与正常对照组细胞总RNA,利用荧光标记dUTP逆转录制备cDNA探针,与人类受体及信号转导类表达谱芯片杂交,并对Cy3、Cy5荧光信号做扫描分析.结果显示有37项基因出现差异表达,其中31项基因在感染后6h出现差异表达,13项下调、18项上调;但在感染后24h和96h分别只有5项和4项基因出现表达差异;而且整合素信号转导通路中的重要基因如一些蛋白激酶相关基因在感染6h表达增强,丝化增强子1在感染6h和96h表达下调,微管相关蛋白1A在感染6h表达上调、感染24h和96h表达下调.这些进一步说明汉坦病毒感染细胞与整合素有关.     

汉滩病毒M片段的核苷酸序列变异和系统发生树分析

The total RNA was extracted from two clinical blood samples of HFRS patients and the RNA was amplified by RT-PCRThe amplified DNA fragment of sample 613 involved nucleotides 1,471-1,873,and the sample 226 involved 540-1,244 nucleotides of M fragment of Hantaan virusThen the amplified PCR products were sequenced directlyThe sequencing results demonstrated that there was 84% identity between sample 613 and HV114 virus strain,but was 99% between sample 613 and HTN76-118 strainHowever,in sample 226,there was 95% sequence identity with HV114,82% with HTN76-118The results of phylogenetic tree analysis showed that HV613 was located in the same linage with HTN76-118,the HV226 was in the same linage with HV114 and A9 strains     

测定T_4-RNA连接酶活力的新方法及tRNA单加反应条件的研究

本文对T_4-RNA连接酶催化tRNA单加pCp的反应条件进行了探讨。tRNA单加pCp的反应在37℃进行1小时,产率一般可达80%以上,条件适当时可达定量产率。利用这个反应建立了一个T_4-RNA 连接酶活力测定的新方法。单加活力单位定义为,在标准条件下,37℃,60分钟,催化tRNA 单加pCp 产生lpmole 产物的酶量为1单加活力单位。1单加活力单位约相当于0.58焦磷酸交换单位。用该方法进行T_4-RNA 连接酶制备过程的活力测定表明,该方法适合于纯酶制剂的活力测定也适合于粗酶制剂的活力测定。     

中国湖北地区HPV16型E6和E7基因变异和进化发生学研究

研究中国湖北地区宫颈癌患者的人乳头瘤病毒16型E6和E7的变异以及HPV16变异体的分布。从宫颈癌患者手术切除标本提取组织DNA,用HPV16 E6和E7特异性引物进行PCR扩增,对扩增的部分E6和E7产物片段进行测序分析。在80例宫颈癌组织DNA中有41例发生E6基因178位核苷酸的突变,突变频率58.75%,相应核苷酸改变为Asp-Glu,E7 647在31例测序样品中有22例发生核苷酸序列A到G改变,使29位氨基酸由Asn变为Ser,突变频率70.97%,结果显示在E6和E7基因的178位和647位核苷酸存在高频率的碱基变异。对E6和E7基因的进化树分析表明,中国湖北地区流行的HPV16病毒株主要为亚洲型变异体(As),其次为欧洲型(E),没有发现非洲-1型(Af-1),非洲-2型(Af-2)和亚洲美洲型(AA)HPV16变异体,中国湖北地区流行的As变异体是否有更高的致宫颈癌的风险还有待于进一步对不同阶段CIN和正常宫颈上皮样品的E6和E7基因进行序列分析和对变异体蛋白进行功能研究。     

固氮酶结构基因在快生型大豆根瘤菌中的定位

分离纯化了一批我国快生型大豆根癌蘸。测定了它们的固氮酶稀性和寄主专一性,发现相同菌株在不同大豆豆种植株上的结瘤和固氮活性差异甚大。蓑国USDA 191和193似寄主专一性较高,在我们所使用的豆种上结瘤能力很低,固氮活性也不高。对根瘤菌中巨型质粒的数量分布进行了分离分析,表明所有快生型大豆根瘤菌都包含1—3个巨型质粒(分子量范围;30-25Md>。用含有固氮酶结构基因的质粒pSA30作为探针对巨型质粒进行杂交,结果表明即使是快生型大豆根瘤菌,固氮酶结构基因也并不一定定位于巨型质粒上。另外,在若干菌株中发现psA30与二个巨型质粒同时杂交,表明有可能nif HDK或其部分基因的拷贝是分散的。