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Recent years have seen a dramatic improvement in protein-design methodology. Nevertheless, most methods demand expert intervention, limiting their widespread adoption. By contrast, the PROSS algorithm for improving protein stability and heterologous expression levels has been successfully applied to a range of challenging enzymes and binding proteins. Here, we benchmark the application of PROSS as a stand-alone tool for protein scientists with no or limited experience in modeling. Twelve laboratories from the Protein Production and Purification Partnership in Europe (P4EU) challenged the PROSS algorithm with 14 unrelated protein targets without support from the PROSS developers. For each target, up to six designs were evaluated for expression levels and in some cases, for thermal stability and activity. In nine targets, designs exhibited increased heterologous expression levels either in prokaryotic and/or eukaryotic expression systems under experimental conditions that were tailored for each target protein. Furthermore, we observed increased thermal stability in nine of ten tested targets. In two prime examples, the human Stem Cell Factor (hSCF) and human Cadherin-Like Domain (CLD12) from the RET receptor, the wild type proteins were not expressible as soluble proteins in E. coli, yet the PROSS designs exhibited high expression levels in E. coli and HEK293 cells, respectively, and improved thermal stability. We conclude that PROSS may improve stability and expressibility in diverse cases, and that improvement typically requires target-specific expression conditions. This study demonstrates the strengths of community-wide efforts to probe the generality of new methods and recommends areas for future research to advance practically useful algorithms for protein science.  相似文献   
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【背景】禽β防御素6是禽体内分泌的一类抗菌肽,在抵抗病原入侵和免疫调节中发挥着重要作用,但其常规表达方式效率较低,难以在产业化生产中加以应用。【目的】建立稳定表达AvBD6的细胞系,并检测其表达产物对耐药大肠杆菌的抗菌活性,为其他防御素表达提供参考。【方法】利用显微镜观察构建真核重组表达载体pLOV-eGFP-AvBD6转染至293T细胞后的转染效率;收集293T细胞上清液并感染DF-1细胞,通过嘌呤霉素加压筛选稳定表达株;利用RT-PCR和Western Blot分别检测目的基因在转录水平和蛋白水平的表达情况;利用扫描电镜观察细胞培养上清液对耐药大肠杆菌的抗菌效果及其对菌体的损伤。【结果】成功构建重组表达载体pLOV-eGFP-AvBD6,筛选出稳定表达AvBD6的DF-1细胞系,而且目的基因在转录水平和蛋白水平均有表达;细胞培养上清显著降低大肠杆菌和副伤寒沙门菌存活率,对金黄色葡萄球菌的抗菌活性较低。【结论】建立了稳定表达AvBD6的DF-1细胞系,其表达产物对耐药大肠杆菌具有良好的抗菌效果,对推动防御素的应用提供技术支持。  相似文献   
7.
枯草芽胞杆菌作为一种遗传背景清晰、基因编辑成熟的革兰氏阳性菌,是多种重要工业酶的生产宿主。随着转录组、蛋白质组、代谢组等多组学测序和分析技术的发展,通过合理设计简化枯草芽胞杆菌基因组,减少细胞内冗余的调控和代谢网络,使得细胞更精简且便于控制,展现出了枯草芽胞杆菌作为异源酶表达宿主细胞的应用潜力。本文简要综述了枯草芽胞杆菌基因组删减的研究进展,归纳了必需基因的确定方法,重点介绍了枯草芽胞杆菌通过删减基因组提升异源酶表达的研究进展及删减策略,充分展示了枯草芽胞杆菌基因组删减在构建异源酶表达底盘细胞中的重要作用。  相似文献   
8.
乳酸菌食品级表达载体的研究与应用   总被引:1,自引:1,他引:0  
乳酸菌是能够发酵糖类产生大量有机酸的革兰氏阳性菌的通称,在发酵食品中有着悠久的应用历史。乳酸菌通常被认为是安全菌株,这些微生物的基因工程操作在食品、医学等方面具有广阔的应用前景。表达载体是基因工程中常用的工具之一,大多数乳酸菌的表达载体通常以抗生素抗性基因作为选择标记,然而抗性基因具有潜在的转移性,因此需要开发食品级表达载体。食品级表达载体不含有抗生素的抗性基因,仅包含来自同源宿主或通常被认为是安全生物的DNA。本文介绍了乳酸菌食品级表达载体的构成及其常用宿主,同时对乳酸菌食品级表达载体的应用进行了归纳总结。  相似文献   
9.
芽胞杆菌属具有良好的蛋白表达和分泌能力,在工业酶的生产中被广泛应用,是理想的工业宿主菌,但实现蛋白分泌表达的普遍高效性还存在许多瓶颈。本文综述了芽胞杆菌的蛋白分泌表达策略,从启动子、信号肽、分泌途径、宿主和培养条件这5个方面总结了提高芽胞杆菌中分泌表达重组蛋白的方法,对芽胞杆菌高效生产工业酶有一定的参考价值,最后展望了优化芽胞杆菌分泌表达的研究方向,各种新型生物技术的发展必将推进芽胞杆菌在分泌表达领域有更深入的应用。  相似文献   
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We re-engineered a classic tool for mutagenesis and gene expression studies in Gram-negative bacteria. Our modified Tn5-based transposon contains multiple features that allow rapid selection for mutants, direct quantification of gene expression and straightforward cloning of the inactivated gene. The promoter-less gfp-km cassette provides selection and reporter assay depending on the activity of the promoter upstream of the transposon insertion site. The cat gene facilitates positive antibiotic selection for mutants, while the narrow R6Kγ replication origin forces transposition in recipient strains lacking the pir gene and enables cloning of the transposon flanked with the disrupted gene from the chromosome. The suicide vector pCKD100, a plasmid that could be delivered into recipient cells through biparental mating or electroporation, harbours the modified transposon. We used the transposon to mutagenize Pectobacterium versatile KD100, Pseudumonas coronafaciens PC27R and Escherichia coli 35150N. The fluorescence intensities of mutants expressing high GFP could be quantified and detected qualitatively. Transformation efficiency from conjugation ranged from 1600 to 1900 CFU per ml. We sequenced the upstream flanking regions, identified the putative truncated genes and demonstrated the restoration of the GFP phenotype through marker exchange. The mini-Tn5 transposon was also utilized to construct mutant a library of P. versatile for forward genetic screens.  相似文献   
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